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(無題) 削除/引用 No.3074-13 - 2014/09/02 (火) 04:50:12 - おお Eosin Y Eosin Yellowish reversibly stains peptides and proteins dark red following SDS–PAGE. Proteins can then be recovered from the gel and further characterized. - See more at: http://www.sigmaaldrich.com/life-science/proteomics/protein-electrophoresis/more-protein-staining-reagents.html#sthash.PDO27C4N.dpuf ちょっと詳細はわかりませんけど。。。 量があるなら、中性付近の溶液によく使われる蛋白に親和性のあるdyeをいれて染色しても何とか見えるようなきもしますけど。。。

(無題) 削除/引用 No.3074-12 - 2014/09/01 (月) 13:51:47 - おお ゲルを全部染色する必要はありません。おそらくマーカがのっけれるwellと幅広いサンプル用の1 laneが用意できるコームか、コームを使わないでやっているだろうと思いますが、サンプルレーンの端(できれば両端)を数ミリのところで縦に切り、レーンの端のゲルを染色(CBBでいいでしょう)でそめてサンプルの位置を確認して、端を除いたゲルは何も処理せずに、確認した位置を切り出せばいいです。CBBなどで染めた場合アルコールが入っているとゲルがちぢんでますので、水に戻すかスキャンしてもとのゲルと同じ大きさになるように画像を拡大してプリントするとかすこし工夫が必要かもしれません。 マーカーとのひかくでどの辺りにくるかわかっているなら、マーカーを指標に場所を決め手切り出してもいいでしょう。 いずれにしろ切り出した後のゲルを残しておくと切り出した部分がずれていると思ったときに、ある程度リカバリーはできます。切り出した後のゲルの端をまたきって染めてみれば、ずれたかわかるかもしれません。

ゲルからタンパクの切り出し 削除/引用 No.3074-11 - 2014/09/01 (月) 12:40:43 - タンパクの切り出し AP様、おお様、名無し様　他皆様方 2014/05に投稿させていただきた、タンパクの切り出しというものです。 　皆様方にアドバイスを頂き、SDS-PAGEで展開・CBB染色したゲル片からタンパクを抽出するのは困難であることを学びました。 　そのため、現在まで（2014/09）アドバイスの中にありました、ネガティヴ染色（リバース染色）を利用して、ネガティヴ染色したゲル片からタンパクを抽出しておりました。 　ネガティヴ染色は、CBB染色より感度が良く、後者は50μg/laneで十分なバンドが見えるのに対し、前者は5 μg/laneで十分なバンドが見え、それ以上濃く流すとバンドが見えなくなってしまいます。 　そのため、一枚のゲルから得られるタンパク量が少なく、抗体作製に必要なタンパク量およそ500-1000μg/ml分を獲得するのが非常に困難な状態です。 現在までに、何十枚と泳動、切り出し・抽出をしましたが、3か月経過しても十分な量を獲得できていません。。。 　何か改善策はありますでしょうか。 　御教授頂きましたら、幸いです。 　宜しくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.3074-10 - 2014/05/28 (水) 20:35:52 - 名無し CBB染色するとメタノールとか酸によりゲル内で蛋白質が変性して不溶化fixationの方の固定）されて、ゲルからは非常に溶出されにくくなります。SDS buffer中とかで潰しても、あまり期待で来ません。なもんでCBBで青く染めた蛋白質のゲルからの回収率はかなり低くく（感じではもともとの量の数％程度とおもう）、特に量の少ない蛋白質ではほぼ絶望的です。なので、ゲルから蛋白質を回収したいならば固定操作せず蛋白質を検出する方法があります。いろいろ試した経験からいうと、銅染色がいい感じでした。お金もかからないし非常に簡単です。この方法では蛋白質のある部分は染まらず、バックグラウンドが白っぽくなり、結果として蛋白質バンドが白抜きになります。ネガティブ染色というやつです。感度的にもクマシーと同等かもう少しいいかんじです。方法はネットでも入手出来ると思いますが、興味あれば下記の論文も参照下さい。 http://ac.els-cdn.com/0003269787905793/1-s2.0-0003269787905793-main.pdf?_tid=e4b74dfe-e65a-11e3-8e52-00000aacb361&acdnat=1401276561_5354b8c900b2d9776493d1ca3799b5f8 似たような方法で冷KClによるゲル染色も昔からありますが、感度とか、バンドの検出具合とかがどうもいまいちあれだったので、銅染色ですることにしました。

(無題) 削除/引用 No.3074-9 - 2014/05/28 (水) 20:32:25 - 独り言 クラッシュってどうやっているんですか？ほんとにただゲル断片をつぶしている？ クラッシュというよりも薄いSDSなどの溶液内で抽出するべきなのではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.3074-8 - 2014/05/28 (水) 15:12:42 - AP 今盛んにロボットによるスパム攻撃をうけているスレにある"Antibodies"を参考にすると、 ウサギを免疫するときの免疫原のdoseは一回あたり500-1000 ugが推奨され、下限が50 ugとなっています。これが初期免疫だけでなく、boosterにもそれぞれ必要になるので、もともと、ちょっと少なすぎるんじゃないでしょうか（マウスならかろうじて可能というレベル）。 なおこの本にも、PAGEからの切り出し、ゲル片を使った免疫、電気溶出などが論じられています。 CBBを使わず溶出可能な染色法として、NaOAc,CuCl2で白濁させる方法がでていました（それと、おおさんのコメントにある切り離した両端だけ染める方法も）。 KClを使う方法はMolecular cloningの古い版にあったかと記憶します。

(無題) 削除/引用 No.3074-7 - 2014/05/28 (水) 14:15:28 - おお 同じ精製方法を2回繰り返しても、移動度の同じ夾雑物は同じところにくるので、そんなによくはならないと思いますが。

(無題) 削除/引用 No.3074-6 - 2014/05/28 (水) 14:04:58 - タンパクの切り出し AP様 多くの方々、御教授ありがとうございます。 2回行う目的は、一回の泳動後に切り出したものより、 目的バンドを切り出して再泳動したものの方が、 共雑物が減ると考えているためです。 より確実なバンドのみが得られると。 1回だけの泳動後に切り出したものでよいなら、 バンドも見えて切りだしているので、いいのですが、 再泳動して見えないというくらい、免疫するタンパク量としては薄いのでしょうか。。。

(無題) 削除/引用 No.3074-5 - 2014/05/28 (水) 10:22:25 - AP あと、免疫原としてつかうだけなら、CBBを脱染色する必要はありません。

(無題) 削除/引用 No.3074-4 - 2014/05/28 (水) 10:21:14 - AP CBB染色のときに酢酸アルコール固定されていると思うが、それでは溶出は困難です。 古典的な方法では、ゲルを濃い目のKCl溶液に浸けて冷蔵庫などで冷やすとタンパク質が白濁してバンドが視認できるというものがあります。当該バンドを切りだして透析膜に入れて電気溶出するなどに利用します。最近では溶出OKな蛍光色素（Syproなんとかとか）染色という方法もあるかと。 ゲル切り出しは１回は不十分なんでしょうか。免疫原に使うくらいだとたいてい一回で十分だと思いますが。50 ugしかないものを２回も泳動、回収すると、避けられないロスで、免疫原の量としては、一羽分も厳しいのではないでしょうか？ なお、PAGEから切り出したタンパク質を含むゲル片をそのままクラッシュして、あるいは乾燥させて粉末状に砕いて免疫するのは私もやったことありますが、決して珍奇ではなく、これも古典的な方法です。

(無題) 削除/引用 No.3074-3 - 2014/05/28 (水) 10:09:13 - おお SDSPAGEのゲルをウサギに打つのはたまにやられる手法ですが、二度流さないといけませんか? 片方の端をきってCBBで染めて場所をきめて切り出すとかやっていったりしていた人がいました(たぶん)

(無題) 削除/引用 No.3074-2 - 2014/05/28 (水) 09:25:29 - al 質問への答えではないですけど、免疫に使う抗原の調製法としてSDS-PAGEは適切なのでしょうか？ タグ付きタンパク質発現 アフィニティー精製 限外濾過で濃縮 の流れが楽だと思うのですが。 ゲルを切り出したものをそのまま免疫に使うということは、ゲルも含まれたままということですよね。 最低限精製したほうがよいと思いますし、1回目の切り出し後に精製してから泳動すればよいのではないでしょうか。

ゲルからタンパクの切り出し 削除/引用 No.3074-1 - 2014/05/28 (水) 08:51:28 - タンパクの切り出し 　 　現在、ウサギのポリクローナル抗体を作製しようと考えている者です。 目的タンパク質（50マイクログラム）を10ウェルのゲル2枚にSDS-PAGEで展開後、CBB染色を行い、目的の大きさのバンドを切り出します。 　切り出したバンドをマイクロチューブに集め、ある程度つぶした後、10ウェルのゲル1枚に再泳動し、再度切り出します。 　切り出したゲルをつぶしたものをウサギに免疫しようと考えております。 　実際に、1度目の泳動でバンドが見えたものを切り出し、再泳動（2度目）し染色した際に、あるはずのバンドが全く確認されませんでした。 ポジティブコントロールのバンドは検出されているので、泳動は失敗していないと思います。 　再泳動する際のゲルからのバンドの回収方法、つぶす（クラッシュ）方法に何かポイントはあるのでしょうか。 　ご教授いただけましら、幸いです。 　宜しくお願い致します。

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