in vitro 系でubiquitin 化反応を行うための基質するリコンビナント蛋白質を大腸菌で作りたいんだがどうよ、みたいな質問かな。なら、それは可能。もちろんフォールディングの失敗とかで正しいコンフォメーションがとれなくて、Ubiquitin化部位にE2やE3、Ubがアクセスできないとか、逆に異常蛋白質と認識されたりして本来ub化されるべき部位と違う部位がub化されたりとかそういう問題は起こりえるとおもうけど。
大腸菌の菌体内あるいはライゼートとかを使ってub化反応が可能かどうかということなら、それは無理。てか大腸菌はubないし。必要な材料全部入れて、とかしないと無理と思うていうか、あえて大腸菌でやらなくてはならない特別な理由がない限りそういうことはしないと思う。
タグ付き標的蛋白質（場合によってはどっかのLysをArgに置換したりとか）あるいはタグ付きUbを培養細胞で発現させて、そこから細胞内蛋白質を抽出して、affinity精製でub化標的蛋白質を回収して、それをいろんな抗体でウェスタンとかで調べるのは標準的実験法として昔からあるけど。もちろんこれはこれでO/Eに伴う問題点など結果は慎重に解釈すべきところはあるけど。
ubじゃないけどその仲間のUBLのなかにはミトコンドリアでなんかやってるやつがあるとかいう論文はみたことあるので、そういうのの祖先型みたいな蛋白質はもしかしたら真性細菌にもあるのかもしれない。
真性細菌のUb-proteasome様システムの存在については、Lon protease subunitsをknock outした細菌で高分子量領域の蛋白質が増えるかどうか一度みてみたら、なんかわかるかもしれない。 |
|
このスレッドをはてなブックマークに追加