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(無題) 削除/引用 No.3052-5 - 2014/05/22 (木) 00:01:00 - GPCR初心者 みなさん、ご意見ありがとうございます。 大変参考になりました。 同じようにしている論文があれば参考になりますが、そうでなければ最終的にはいろいろ試すしかないみたいです。 いくつか作って試してみます。

(無題) 削除/引用 No.3052-4 - 2014/05/21 (水) 19:15:09 - サンショウウオ リガンド側なら、AF488-SE　とか、サイズが小さい蛍光色素をN末端のアミノ基に修飾したのが受容体に結合したのを共焦点レーザー顕微鏡で確認したことありますが。。。

(無題) 削除/引用 No.3052-3 - 2014/05/21 (水) 14:48:21 - おお >[Re:2] てんさんは書きました : > タグをつけるときに考慮しなければならないのは立体障害です。 > > GFPはかなり大きくN末につけるとリガンドとの相互作用が抑制される可能性が高いので、普通はC末につけるのだと思います。 そうなんですか?Nまつはかなり自由度がある様に見えます。N-末から膜にはいるtransmembraneの部分を1としてNまつから順番に番号をいれていくと、典型的なモデルではNまつからはなれた3, 5, 6, 7の膜ドメインがconformational changeをライガンド依存的に起こすようです。 N末につけづらい理由は単純に膜蛋白でシグナル配列をつぶしたくないようなきがしたのですが、ligand阻害の可能性を指摘するのはなにか特別な訳があるのでしょうか?それとも細胞の外に出ているからということでしょうか? N末にいれると状態によっては膜のとポロジーを乱すかもしれませんね。 > リガンドへのタグについても、構造的に問題ないかをあらかじめ調べるべきです。 > よく知られているリガンドであれば構造解析がされている場合もあるので、N末でもC末でも結合を阻害しない方にタグをいれることは可能だと思います。 具体的にどの様に調べれるのでしょうか?タグを入れた状態で構造が決まってなければタグのところがどの様に入り込むかわからないかと、、、末端認識がされているとかは判断ができるかもしれませんね。そうでなければある程度スペースがあるなら、エネルギーが低い高いは別としてどうとでもシミュレーションではけっこう自由に折り曲げてしまえるし、、、 結晶化で決まっている構造も、溶液では自由度がある部分もあるだろうし。 スーパーインポーズで安定性をみることはできるかもしれませんが。

(無題) 削除/引用 No.3052-2 - 2014/05/21 (水) 13:00:45 - てん タグをつけるときに考慮しなければならないのは立体障害です。 GFPはかなり大きくN末につけるとリガンドとの相互作用が抑制される可能性が高いので、普通はC末につけるのだと思います。ただ、C末につけた場合は、GPCRに結合する細胞内タンパク質との相互作用を阻害する可能性があるので、シグナルを見たい場合は適切ではない場合もあります。 リガンドへのタグについても、構造的に問題ないかをあらかじめ調べるべきです。 よく知られているリガンドであれば構造解析がされている場合もあるので、N末でもC末でも結合を阻害しない方にタグをいれることは可能だと思います。 NCBIのデータベースの中の"Structure"などで調べられます。 あと、短いペプチドであれば修飾アミノ酸で置換することも方法として考えられます。 またタグとの間のリンカーの長さを調節して立体障害を減らす事もできますが、結局はいろいろいじって条件検討になるでしょう。

GPCRとそのLigandにタグをつけたい 削除/引用 No.3052-1 - 2014/05/21 (水) 04:23:47 - GPCR初心者 あるGPCRについての研究テーマを与えられたのですが、今のラボではあまり行ったことがある人がいないため、皆さんにお伺いできればと思っています。 行いたいことの一つは人の細胞に発現させたGPCRとそのLigandとの結合を見ることです。 多くのGPCRはペプチドをLigandにしています。 bradykinin receptorではもちろんbradykinin (Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg)がそのLigandですが、実験上タグをつけることができれば大変やりやすいです。 そこでお伺いしたいことは、 1）GPCRにタグをつける際には多くのものはC末につけているみたいですが、これは何か理由があるのでしょうか？それともN末でも問題なくその昨日を発揮できるのでしょうか？つけたいタグはGFPです。 2）Ligandのペプチドにも違うタグ（Hisタグ）をつけたいと思っているのですが、タグがついたペプチドがGPCRにちゃんと結合するものなのでしょうか？その場合、N末かC末のどちらにつけるのがいいものなのでしょうか？もしご存知の方がいらっしゃったらぜひ教えてください。よろしくお願いいたします。

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