BioTechnicalフォーラム [ユビキチン化の検出について]

ユビキチン化の検出について

No.3051-TOPIC - 2014/05/20 (火) 21:31:24 - ユビキチン

ユビキチン化の検出に関する実験で教えてください。

ユビキチン、E3ユビキチンリガーゼ、標的のタンパクを発現するベクターをcotransfectionして、MG132などのプロテアソームインヒビターを加えて実験されると思いますが、E2やATPなどを加えて実験しているものも良く見かけます。目的タンパクのユビキチン化を見る場合、E2やATPは必要なのでしょうか？

経験者のご意見をお聞かせください
　

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No.3051-8 - 2014/05/21 (水) 13:31:31 - おお

>インヒビターについては特異性がどのくらい高いかということが問題で、MG132はproteasome以外のプロテアーゼも阻害するので、プロテアソーム依存的分解ということを示す実験ならば問題ある。

MG132は選択性があって、他のプロてあーぜの10倍ほど低い濃度でプロテアソームをそがいするから、濃度で調整すればいいのでは?

それと、こういう阻害剤をつかっても、プロテアソームじしんがいろいろなプロテアーゼの複合体なので、完全に止めているわけでなく、それがりゆうでインビビターにタンパク質選択性がみられるようなので、使ってみながら確かめていくしかないのではと。

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No.3051-7 - 2014/05/21 (水) 03:26:47 - 独り言

すでに指摘がある通りMG132は特異性が低いのであまりおすすめしません。ただ安いのでよく使われています。lactaの方がよいです。ただちょっとお高い。
処理時間は、薬剤によってではなく、細胞や分子によって変わってくるのだと思います。

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No.3051-6 - 2014/05/21 (水) 02:27:54 - 名無し

ユビキチン化に必要なものは一通り細胞内にあるとおもうんだが、なんでわざわざトランスフェクションして発現させるのかがちょっとあれなんだが、てか標的蛋白質を強制発現させるのは実験の都合上場合によってはしかたないとしても、それ自身細胞にとってはある意味異常蛋白質なわけで、それでユビキチンプロテアソーム系で認識されて処理されるとかだと、なにを見てるかが怪しくなってくる気がするんだが。

インヒビターについては特異性がどのくらい高いかということが問題で、MG132はproteasome以外のプロテアーゼも阻害するので、プロテアソーム依存的分解ということを示す実験ならば問題ある。

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No.3051-5 - 2014/05/20 (火) 22:05:47 - ユビキチン

独り言さん

ありがとうございます。
アッセイの際にプロテアソームインヒビターを入れると思いますが、私が調べた限りだとMG132が多いと思います。その次がlactasistinでしたが、処置時間がMG132で4時間、lactaで24時間ほどだったと思います。
実際のところ、インヒビターによってユビキチンのバンドの見え方は結構違うものなのでしょうか？

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No.3051-4 - 2014/05/20 (火) 22:01:56 - 独り言

> トランスフェクションの場合必要ないのはエンドのE2が働くことで検出可能ということでよろしいでしょうか？

そのユビキチン化が用いている細胞で内在的に起こると考えられるなら内在性のE2で十分でしょう。

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No.3051-3 - 2014/05/20 (火) 21:53:04 - ユビキチン

独り言さん

お返事ありがとうございます。

トランスフェクションの場合必要ないのはエンドのE2が働くことで検出可能ということでよろしいでしょうか？
実験系としては細胞で検出するほうが難しそうですが、目的の実験によって使い分けるのでしょうね。
勉強になります。

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No.3051-2 - 2014/05/20 (火) 21:48:32 - 独り言

E2やATPを加えているのはin vitroでの実験系なのではないでしょうか？
細胞にトランスフェクションするだけなら必要はずですけど。