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(無題) 削除/引用 No.3049-16 - 2014/05/22 (木) 19:43:47 - AP Molecular Cloning 3rd ed(4thは所有していませんで、、）のChapter 15-51,52にプロトコールの例があります。Tx100を使う方法と尿素を使う方法です。 出典は http://www.nature.com/nbt/journal/v2/n9/abs/nbt0984-800.html http://www.nature.com/nbt/journal/v3/n2/abs/nbt0285-151.html

(無題) 削除/引用 No.3049-15 - 2014/05/22 (木) 18:12:15 - よねちゃん 詳しく説明していただきありがとうございます。 PBSで一気に希釈というのはPBSで透析するのではなく、サンプル溶液に直接PBSを添加するということですか？

(無題) 削除/引用 No.3049-14 - 2014/05/22 (木) 17:57:41 - mon ”infusion body”ではなく、”inclusion body”でした。失礼しました。

不溶化したタンパク質の繰り返し洗浄 削除/引用 No.3049-13 - 2014/05/22 (木) 17:55:02 - mon 不溶化したタンパク質の繰り返し洗浄について、 不溶化したタンパク（沈殿、infusion body）を可溶性の不純物から分離・洗浄することです。 infusion bodyを溶かさないような溶液、たとえばPBS-1%TritonX100に懸濁し、遠心して沈殿を集めます。この手法は沈殿の表面に付着している不純物を洗うことになります。 しかし不純物が目的物と一緒に不溶物になっていることも多いため、効果的でないことも多いです。 そのため沈殿を尿素やグアニジンで溶解、これをPBS等で一気に希釈すると、ある程度の不純物は可溶性になり、遠心して上清を捨てると、不純物は沈殿画分から減っていきます。このような可溶化＞不溶化を繰り返していきます。 不純物の分子量が目的物と離れているなら、尿素等で可溶化した状態でゲル濾過で分離することもあります（当然カラムは溶解液で平衡化しておく）。

(無題) 削除/引用 No.3049-12 - 2014/05/22 (木) 17:25:22 - よねちゃん APさん、monさん返信ありがとうございます。 たしかに少しカラム精製にこだわりすぎていた気がします。 繰り返しの洗浄について詳しく聞きたいのですが、尿素で可溶化させた後のサンプル(上清)を洗浄するのでしょうか？ また洗浄バッファーはPBSのようなもので大丈夫でしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3049-11 - 2014/05/22 (木) 16:07:14 - AP monさんのコメントはスルーされていますけれど、すんなり可溶化発現できたのならともかく、不溶化が免れないタンパク質であればアフィニティー精製に固執する必要はないと思います。不溶性タンパク質を可溶化してアフィニティー精製を行う場合、うまくいくこともあれば、条件を検討してもどうしてもアフィニティー吸着できないこともあります。 アフィニティータグによる精製法は簡便さのために開発されて来ましたが、コンベンショナルなタンパク質精製法は今でも有効であるし、なにもアフィニティー精製だけが唯一目的を達する方法というわけでもないでしょう。どうせHis-tagだと内在性タンパク質でくっついてくるのもたくさんあって、アフィニティーカラムだけではそれほど高純度にはならないのだから、不溶化したタンパク質を繰り返し洗浄するだけでもそれくらいの精製度にはなるかもよ。

(無題) 削除/引用 No.3049-10 - 2014/05/22 (木) 15:28:36 - おお 尿素は電離しませんので、チャージによる相互作用は直接的には干渉しません。支持体がurea耐性であるものを選べばいいです。 ただし、人によってはUreaからの若干の分解によるイオンの発生を気にして、イオン交換れじんで除去してからつかうひともいます。

(無題) 削除/引用 No.3049-9 - 2014/05/22 (木) 14:43:04 - よねちゃん イオン交換カラムは尿素バッファー中だと使用できないということを聞いたことがあるのですが、8M尿素中でも使えますか？

(無題) 削除/引用 No.3049-8 - 2014/05/22 (木) 14:33:16 - よねちゃん pHはカラムにロードする前に確認していますが、pH8.2ほどあります。 次はバッファーをNa2HPO4に変えてやってみます。

(無題) 削除/引用 No.3049-7 - 2014/05/22 (木) 10:43:36 - おお >[Re:6] よねちゃんさんは書きました : > カラムはNiセファロースカラムを使っています。 > > 吸着しなかったというのはflow throughに目的タンパクが出ているという意味です。Elutionには全くいません。還元剤はS-S結合がヒスタグを覆っているかもしれないという考えから添加しました。 > > またバッファーは8M Urea、0.1M NaH2PO4、0.01M Tris-HCl(pH8.0)を用いました。洗浄バッファーは50mMイミダゾールを溶出バッファーは300mMイミダゾールをここに加えています。 0.1M NaH2PO4、0.01M Tris-HCl(pH8.0)でpH8になってますか、7とかそれ以下だと吸着はきびしいです。NaH2PO4は酸性で、100mMも入っているので。。。NaH2PO4ーNa2HPO4でバッファー作った方がいいような気がします。 イミダゾールは吸着の時の濃度を下げてみてください、還元剤はいれてもかわらなかったということだったら入れる意味はないでしょう。

(無題) 削除/引用 No.3049-6 - 2014/05/22 (木) 10:17:32 - よねちゃん カラムはNiセファロースカラムを使っています。 吸着しなかったというのはflow throughに目的タンパクが出ているという意味です。Elutionには全くいません。還元剤はS-S結合がヒスタグを覆っているかもしれないという考えから添加しました。 またバッファーは8M Urea、0.1M NaH2PO4、0.01M Tris-HCl(pH8.0)を用いました。洗浄バッファーは50mMイミダゾールを溶出バッファーは300mMイミダゾールをここに加えています。

(無題) 削除/引用 No.3049-5 - 2014/05/20 (火) 19:29:15 - おお 還元剤はNiカラムにはよくないですよ。もし非特異の吸着を押さえるために若干のヒスチジンを入れているならぬいてみてください。 バッファーのpHはいくらでしょうか?そのpHはカラムにアプライするときに保たれているでしょうか?pH7.5以上はほしいです。バッファーはなにをつかってますでしょうか?Niカラムと相性の悪いばっふぁーもありますよ。TRISはアクセプタブルですが、場合によっては弱いNiカラムとの相互作用は阻害する可能性があります。 つかないというのは、ものがflow throughに出たということでしょうか? このステップでつぼにはまっているようならイオン交換にかえてもいいかもしれませんよ。 気休めにグアニジンを尿素の代わりにつかってもいいかもしれませんけど。 もしかしたら夾雑物が吸着を阻害しているかもしれませんので、薄めるか透析してみるのも手かもしれませんね。もちろん外液に尿素いれておけばいいです。

(無題) 削除/引用 No.3049-4 - 2014/05/20 (火) 18:09:38 - mon 粗精製液中の不純物（アミノ酸等）が邪魔しているとすると、薄めて沈殿を集め、再度溶解、希釈して沈殿を5回~8回ほど繰り返すと、不純物を大幅に減らすことができます。

(無題) 削除/引用 No.3049-3 - 2014/05/20 (火) 17:34:03 - qw 可溶化バッファー、洗浄、溶出バッファーの組成、Ni-カラムの製品名を提示すべきです。 「吸着しませんでした」とは、アプライした時の素通りに可溶化液と同じ濃度のヒスタグたんぱく質が検出されたということですか？ 還元剤の添加は吸着を阻害すると言いますから、なぜここで還元剤を添加したのか良く解りませんが、やってみたけどやっぱり結合しなかったということですか？ Ni-カラムは、予め結合している（もしくは最初から結合している）ものを使っているますよね？

(無題) 削除/引用 No.3049-2 - 2014/05/20 (火) 17:19:25 - ~ 尿素の許容濃度で8Mと書かれているものがありますが、 使用されているのはそのような規格を持ったカラムなのでしょうか？ https://www.nacalai.co.jp/products/new/05.html

タンパク質の粗精製について 削除/引用 No.3049-1 - 2014/05/20 (火) 15:34:18 - よねちゃん ヒスタグが付いたタンパク質を大腸菌で発現させ、8M尿素で可溶化しています。その後、Niカラムで精製しようとしましたが吸着せず、還元剤を加えてみましたが吸着しませんでした。 また尿素の濃度を薄めるとすぐ沈殿が出てしまうので、8Mのまま精製したいと考えています。 どなたかアドバイスお願いします。

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