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(無題) 削除/引用 No.3046-19 - 2014/05/31 (土) 07:30:20 - 分泌タンパク 2Dワークしました。非還元で140kDaのバンドは２次元目で70kDaのA1-GFP（と思われる）場所に濃縮されました。A2の抗体も届いたので、この系でA1-GFPの複合体をもう少し詳しく調べてみようと思います。おおさん、どうもありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.3046-18 - 2014/05/29 (木) 14:54:36 - おお >[Re:17] 分泌タンパクさんは書きました : > もしよろしければ、隙間を埋めるアガロースゲルの、bMEの濃度を教えてもらえませんでしょうか？　またこの場合のstackingバッファーストックというのは結局Tris(6.8)のみと理解してよろしいでしょうか？ trisのみです。 bMEはすでにきったゲルを処理していればいらないのですが、volume の1/10ぐらい入れたりします。

(無題) 削除/引用 No.3046-17 - 2014/05/28 (水) 07:32:16 - 分泌タンパク ２次元目の還元での泳動ですが、分離ゲルの上に1cm弱の幅でstackingゲルをあらかじめ固めておいてから、切り出した１次元目のゲルを挿入して、周りをさらにstacking（今回は準備不足で還元剤入りのアガロースは試せませんでした）で埋めて見たところ、気泡の混入もなく、うまく泳動できました。明日ブロットの結果を見て、問題があるようなら、隙間を還元剤入りアガロースで埋めてもう一回トライしてみます。どうもありがとうございました。 もしよろしければ、隙間を埋めるアガロースゲルの、bMEの濃度を教えてもらえませんでしょうか？　またこの場合のstackingバッファーストックというのは結局Tris(6.8)のみと理解してよろしいでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3046-16 - 2014/05/27 (火) 04:54:09 - おお >[Re:15] 分泌タンパクさんは書きました : > ありがとうございます。何か根本的な事が理解できていないような気がするので、何点か確認させて下さい。 > > （１）２次元目のSDS-PAGEのstacking gelを作る際、大きな１wellのコームを使って最初にstacking gelを作っておいて、その大きなwellに切り出したレーンをはめ込むプロトコールを見かけますが、これは必須なのでしょうか？　残念ながら、そのようなコームを持っていないので、今回は切り出したレーンをまず挿入し、わきからstacking gelを流し込んだのですが、固まる過程で気泡ができてしまいました。 絶対にいるとまではいいません。両脇に通常の1laneと同じlaneがあると、マーカー、ポジティブコントロールがおけますので、、、 すタッキングゲルはあった方がいいので、もしそう言うコームがなければ、数ミリの高さのスタッキングをあがロースでもアクリルアミドでもいいから作った方がいいとおもえます。 > > （２）おおさんの方法は、大きなwellに切り出したゲルを挿入後、隙間をアガロースを含むstacking gelで埋めるという事でしょうか？　それとも、最初に切り出したゲルをはめ込んでおいて、stacking gel全体をアガロース入りのもので流し込むという事でしょうか？ ちょっと違いがわからないですが、切り出したレーンごと幅の広いwellにゲルをいれて、間隙をあがロースでうめています。 挿入したゲルがあがロースに完全につかった状態になるまでfill upしてます。一回りうすいゲルを使うようにしてますのでゲル側面にも間隙ができるのでそこも埋めるということです。そうしないと挿入したレーンがえいどう中浮いてくることがあります。 >TEMEDも含めstacking gelの成分は通常通りで、そこにアガロースが0.7%になるように アクリルあみどはいりません。代わりにあがろーすを使いますから。なのでTEMEDやAPSも不要です。ゲルはbMEなどの還元剤で処理していますし、APSは酸化剤なので、アクリルあみどの重合にあまりよくないのではと想像しています。

(無題) 削除/引用 No.3046-15 - 2014/05/27 (火) 03:45:28 - 分泌タンパク ありがとうございます。何か根本的な事が理解できていないような気がするので、何点か確認させて下さい。 （１）２次元目のSDS-PAGEのstacking gelを作る際、大きな１wellのコームを使って最初にstacking gelを作っておいて、その大きなwellに切り出したレーンをはめ込むプロトコールを見かけますが、これは必須なのでしょうか？　残念ながら、そのようなコームを持っていないので、今回は切り出したレーンをまず挿入し、わきからstacking gelを流し込んだのですが、固まる過程で気泡ができてしまいました。 （２）おおさんの方法は、大きなwellに切り出したゲルを挿入後、隙間をアガロースを含むstacking gelで埋めるという事でしょうか？　それとも、最初に切り出したゲルをはめ込んでおいて、stacking gel全体をアガロース入りのもので流し込むという事でしょうか？ （３）切り出したゲルを最初に挿入しておいて、stacking gelを流し込む形でよいのであれば、おおさんの方法を試してみたいのですが、この方法では、stacking gelにアガロースを混ぜて固めると理解して良いでしょうか。この場合、TEMEDも含めstacking gelの成分は通常通りで、そこにアガロースが0.7%になるように加わった組成に最終的になっていれば良いという事でよろしいでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3046-14 - 2014/05/25 (日) 03:57:32 - おお もしsample bufferがじゃまするなら、BNと違い蛋白はすでにSDSでへんせいされてますので、かんげんざいがばっふぁーに入っていれば大丈夫でしょう。 私はBNで紹介されているプロとコールはあまり確認してませんが、手持ちにあるものでやれるようにせっとあっぷしました。 1 or 0.75の厚さのgelで流し、1.5とかより厚いgelで2Dをしてます。 切り出したlaneを挿入して、0.6-7%のあがロースを熱してとかし、そこにstacking buffer stock、SDS、bMEを加えてゆっくり流し込んでlaneの下に泡がはいらないようにしてます。基本的に厚みが一回りうすいので、操作しやすいです。 あがロースがかたまったら(一時的に冷蔵庫とかに入れても可)gelをセットして、若干サンプルバッファーをじゅうそうしてえい動を開始してます。

(無題) 削除/引用 No.3046-13 - 2014/05/23 (金) 02:05:59 - 分泌タンパク 現状報告します。6%SDS-PAGEで非還元のサンプルを流し、transfer bufferのMeOHを5%まで落としてPVDF膜に転写しました。CBB確認用（転写なし）のゲルで見られた250kDaより大きなバンドが、転写後のゲルのCBBでは見えなくなり、マーカーも全部転写されたため、高分子の転写については改善されたと考えられます。転写後の膜を還元剤で処理してGFPのウエスタンを行いましたが、今回もブランクでした。ところが念のために行ったA1の抗体でのリブロットでは、マーカーからの推測で 55kDa および140kDaあたりにしっかりしたバンドが確認されました。現時点で55kDaのバンドはA1-GFPのモノマーと考えていますが、140kDaのバンドについてはA1-GFPのホモダイマーなのか、他の蛋白との複合体なのか不明です。 おおさんのアドバイスにしたがい、本日6%SDS-PAGEで流した非還元サンプルのレーンを切り出し、サンプルバッファーで処理した後、10%SDS-PAGEのstacking gelに埋めてみました。残念ながら、stacking gelが中途半端にしか固まらず、切り出したレーンの端に気泡ができてしまったため、切り出したゲルの端に残っていたサンプルの色素が半分くらい、２回目の泳動中にstacking gelとの境界からリークしてしまいました。サンプルバッファー処理後の洗浄が不十分だったためと思われますが、この場合、洗浄はどの程度やれば良いのでしょうか。洗浄はSDS-PAGEのランニングバッファー（Tris/Glycine + 0.1%SDS）で行いましたが、これで良いのでしょうか？ 再々申し訳ありませんが、よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.3046-12 - 2014/05/21 (水) 03:00:39 - 分泌タンパク 独り言さん どうもありがとうございます。キットの中身を理解しないで使ってる事がバレました（汗）。GFP trapはCamelか何かのH鎖抗体でしたでしょうか。L鎖がないのでSS結合を気にしないで良いという事ですね。IPのところから還元剤有無でやってみます。最後はSDS buffer（還元剤有無）で煮沸してみます。 おおさん どうもありがとうございます。GFPによるマルチマーは気にしなくて良いようで、安心しました。2Dのウエスタンはまったくやった事がないのですが、今回初めてBN-PAGEのプロトコールを読んでみて、ゲルの埋め込みであればできそうな気がしてきました。とりあえず新規の備品を買う必要がないのでトライしてみます。まずはBNではなく、非還元のSDS-PAGEからレーンを切り出して、還元剤処理後、横にしてstuckingに埋めて流してみます。

(無題) 削除/引用 No.3046-11 - 2014/05/20 (火) 19:14:54 - おお GFPを介してのだいまーはかなり相互作用はよわいですし、SDSPAGEでは外れると思います。

(無題) 削除/引用 No.3046-10 - 2014/05/20 (火) 19:01:52 - おお >[Re:7] 分泌タンパクさんは書きました : > 皆様、ありがとうございます。 > > 非還元のゲルを切り出して2Dというのは、BN-PAGEのnativeのゲルを切り出してSDS-PAGEのstucking gelに埋め込み、還元条件で2Dにするのと、同じような感じでいいのでしょうか？　この場合は、切り出したゲルを還元処理してから埋め込む事になるのでしょうか？ そうです。プロとコールもBNのあとのSDSPAGEとほぼいっしょでいいでしょう。 60度ぐらいの sample bufferに2、3分浸してゲルを埋め込めばいいです。

(無題) 削除/引用 No.3046-9 - 2014/05/20 (火) 17:13:46 - 独り言 > FLAG-tagのコンストラクトも持っているので、コトランスフェクションもやってみようと思います。「還元剤有無でIP」というのは、GFPあるいはFLAGで免沈して最後の抽出を還元剤あるなしでやるということでよろしいでしょうか？ IP中とwash bufferに還元剤入りもしくはなしで行えばいいと思います。抗体を用いたIPだともしかすると抗体が還元剤で変なことになってしまうかもしれませんが、GFP-TrapならSS結合ないから大丈夫でしょう。

(無題) 削除/引用 No.3046-8 - 2014/05/20 (火) 14:11:57 - 分泌タンパク ほしさん GFP trapの実験では、最後の抽出を還元剤が入ったSDS buffer内での煮沸で行ったので、このサンプルは還元されてしまっています。GFP trapあるいは通常のIPで、還元剤なしのSDS buffer内で煮沸した場合、抗体に結合した蛋白を回収可能でしょうか？　可能であれば、もう再度GFP trapを行い、還元剤なしで回収する実験をやりたいと思っています。それとも、GFP trapの場合はfree GFPとの競合で抽出するべきでしょうか？ qwさん Mass specでは、A1、A2とも60%程度のcoverageでペプチドが同定され、そのほとんどがそれぞれに特異的な配列でした。ホモログといっても、アミノ酸１０個前後にわたって完全に配列が一致するところがほとんどなく、RやKの分布も結構異なっています。よって、３）と考えて良いと思いますが、A1についてはendogenousではなくA1-GFPのdegradationを見ている可能性があります。A1の抗体でのウエスタンでは、HEK293T（mockコントロール）の上清を濃縮してもendoのA1を検出できないので、分泌されているとしてもかなり少量と思われ、どちらかというと、A1-GFPとendo A2のヘテロダイマーの形で分泌されている可能性を考えています。A2の抗体を先日注文したところなので、届き次第、とりあえず還元サンプルでチェックする事にしています。

(無題) 削除/引用 No.3046-7 - 2014/05/20 (火) 13:33:54 - 分泌タンパク 皆様、ありがとうございます。 おおさん おっしゃられているように色々な形でマルチマーを作って分散している可能性もあると思うのですが、非還元と還元サンプルをサイドバイサイドで流して、還元サンプルの70kDaのバンドが強く検出できる状況でも、非還元のレーンは完全にブランクになってしまうので、非還元でのサンプリングに技術的なミスがあるような気がしてならないのです。非還元やnativeのウエスタンの経験がほとんどないので、自分のやってる事自体があまり信用できない状況です。GFP tagの場合、GFPを介してマルチマーになってしまう事もあるのでしょうか？ 非還元のゲルを切り出して2Dというのは、BN-PAGEのnativeのゲルを切り出してSDS-PAGEのstucking gelに埋め込み、還元条件で2Dにするのと、同じような感じでいいのでしょうか？　この場合は、切り出したゲルを還元処理してから埋め込む事になるのでしょうか？ 独り言さん FLAG-tagのコンストラクトも持っているので、コトランスフェクションもやってみようと思います。「還元剤有無でIP」というのは、GFPあるいはFLAGで免沈して最後の抽出を還元剤あるなしでやるということでよろしいでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3046-6 - 2014/05/20 (火) 09:32:17 - qw ＞40kDaのバンドが見られ、そのバンドのmass spec解析でA1とそのホモログで ＞あるA2が同定されました。 massで測定されたのは、 １）A1もしくはA2。共通部分のフラグメントのみが検出されている。 ２）A2特異的なフラグメントを検出出来ているので、A2である。但し、A1を含まないことを示せない。 ３）A1特異的＋A2特異的なフラグメント（もしくは配列）を検出できたので、A1とA2を共に含んでいる。 のなかの、２）か、３）なのですよね？

(無題) 削除/引用 No.3046-5 - 2014/05/20 (火) 05:17:28 - ほし もともとの、GFP trapで落としたタンパク質を非還元の状態でSDS-PAGEとCBB染色すると予想した通りの分子量にバンドが出るのですか？

(無題) 削除/引用 No.3046-4 - 2014/05/20 (火) 04:03:21 - 独り言 非還元のウエスタンはよくわかりませんが、 過剰発現でいいのであれば、 別々のタグをA1につけ（A1-GFPとA1-Flag)、コトランスフェクションして還元剤有無でIP。 もしくは培養上精を還元剤有無でスクロースグラジェントで分子量で分ける。ゲル濾過より簡単。 0-20%スクロースぐらいであれば40と80kDaを分けれると思う。内在性だからより生理的な意味があるし。

(無題) 削除/引用 No.3046-3 - 2014/05/19 (月) 23:31:18 - おお A2も強制発現させてみればみやすくなるかなぁ。。。

(無題) 削除/引用 No.3046-2 - 2014/05/19 (月) 23:28:48 - おお S-S結合を介していろいろな蛋白と複合体をとっていて、非還元状態ではバンドが分散して検出しにくくなってるんでしょうか、、、他の蛋白の関与もあるかもしれませんが2:2とかで複合体とっているとか、1:1がユニットになっていてそれがまるチマーになる能力があるとか。GFPtagどうしでもだいまーになる可能性があるなら、1:1の複合体のサイズは3通りになりますよね。。。 全体的に非還元状態では還元状態ほどバンドがシャープにならないというのはあります。 非還元のレーンをきりだして、一回り厚いSDSPAGEゲルにのせて、還元状態でながして2Dにすると検出感度が上がり見やすくなることがあります。 レーンの幅に広がっている蛋白が濃縮されてスポットになりますから。 >これまでは単に還元剤を含まないSDS bufferと混ぜて５分煮沸 基本これでいいとおもいます。煮沸の温度は場合によっては60度とか、低い温度のほうがいい場合もありますが、、、還元状態でうまくいっているので、、、やってみることまで否定しませんが BN-PAGEなんかもやってみる価値があるかもしれません。

非還元サンプルのウエスタン 削除/引用 No.3046-1 - 2014/05/19 (月) 20:06:58 - 分泌タンパク 非還元サンプルのウエスタンについて、皆様のご意見を伺えませんでしょうか。 分泌タンパクA1（40kDa）のC末にGFPを付加したA1-GFP（70kDa）を、強制発現したHEK293Tの培養上清からChromoTek社のGFP trapで落としたところ、SDS-PAGEのCBB染色でA1-GFPと思われるバンドの他に40kDaのバンドが見られ、そのバンドのmass spec解析でA1とそのホモログであるA2が同定されました。A1は分子間SS結合によりホモダイマーを形成する事が知られているため、A1-GFPもendogenousのA1及びA2とSS結合していると考え、培養上清のGFP抗体でのウエスタン（8%SDS-PAGE、ニトロセルロース膜でsemi-dry transfer）を、非還元および還元条件で 行いました。予測としてはA1-GFPのホモダイマー、A1-GFPとendoA1あるいはendoA2のヘテロダイマー、より高分子のオリゴマー、などに相当するバンドが非還元条件で検出される事を期待したのですが、 非還元ではモノマーも含めまったく検出されませんでした。この抗体が非還元GFPを検出できない可能性については購入先に問い合わせ中ですが、全長のGFPを免疫原として得られたpolyclonalでIPにも使えるとされているので、非還元GFPにもある程度は結合すると予測されます。今後A1及びA2の抗体で非還元サンプルのウエスタンを 予定していますが、まずはGFPウエスタンの問題解決が先と考えています。 とりあえず、（１）A1-GFPが高分子複合体を形成して転写がうまく行っていない可能性を考え、6%SDS-PAGEでゲルのCBB及びwet transfer（PVDF膜、5%MeOH/TrisGlycine +/- 0.01%SDS ）でのウエスタン、（２）非還元GFPと抗体との結合が最適ではない可能性を考え、転写後の膜の還元剤での処理、を予定しているのですが、非還元条件でのサンプル調整でも少し工夫できないか案じています。A1には複数のCys残基があり、そのうちの一つが分子間SS結合、他は分子内SS結合に関与するので、非還元条件では分子内SS結合が残るのですが、これがA1の SDS化や泳動度に影響する可能性があり得るでしょうか？　また、これまでは単に還元剤を含まないSDS bufferと混ぜて５分煮沸でサンプルとしていましたが、過去ログを見ると、凝集を防ぐため低温で長時間加熱する方法などもあるようで、試してみる価値があるでしょうか？　あるいは方法論そのものを変える（ゲル濾過やBN-PAGEなど）ほうが良いでしょうか？　この手の実験の経験があまりなく、皆様のご意見が伺えるとありがたいです。よろしくお願いします。

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