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(無題) 削除/引用 No.3042-7 - 2014/05/18 (日) 02:55:21 - おお 溶かすというのであれば尿素がまず浮かびますね。ただ尿素をくわえると、加熱処理をしない法がいいです。凍結乾燥にしてもスピードバックにしても乾燥するときバッファーの成分の一部が飛ぶとpHが極端に偏るので(たとえばTris-HClならHClが飛ぶとか)、またバッファーも高濃度に濃縮されるので、乾燥させると完全に飛ぶような炭酸アンモニウムなどを使うことがおおいです。 今回の目的はSDSPAGEのようなので、蛋白の変性とかあまり気にしないでいいので、よりマイルドな方法をとる必要はないと思いますので、分解の可能性がなければスピードバックでもいいかもしれませんが、解けにくいのはたしかですね。TCA沈殿でも解けにくいのは解けにくいです。

(無題) 削除/引用 No.3042-6 - 2014/05/18 (日) 01:27:10 - Zumi ありがとうございました。簡便な方法のため今回の試しましたが、他にも方法があるのですね。ご意見伺ったところあまり良い方法ではないと感じました。今後は別の方法も含めて検討してみます。

(無題) 削除/引用 No.3042-5 - 2014/05/17 (土) 22:35:20 - qw 私も「濃縮させるために遠心バキューム」はあまり良い方法だとは思えません。凍結乾燥か、有機溶媒沈殿やTCA沈殿の方がよいと思います。 細胞抽出用緩衝液の殆ど全ての成分がペレットに来ているだろうから、その組成によって対処が異なります。 抽出用緩衝液が炭酸アンモニウムや酢酸アンモニウムのような揮発性の緩衝液だけであれば、ペレットを90%EtOH、100%EtOHで懸濁（脱塩・脱脂）遠心して、沈殿を再度完全に乾燥すると、サンプルバッファー＋6M Ureaで溶けるようになるかもしれません。Urea入りのサンプルバッファーの時はボイルしてはいけません。 いずれにしてもペレットを比較的薄い膜状に沈殿できる方が、その後の溶解に有利ですから、丸底のエッペンを使う方が良いかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3042-3 - 2014/05/17 (土) 21:53:26 - 名無し 遠心バキュームってスピードバックコンセントレーターのことかな。あれは有機溶媒に溶かしたペプチドにはいいと思うけど、蛋白質には向かないとおもう。カラカラに固まって容易には溶けなくなる。蛋白質なら凍結乾燥がいいとおもう。凍結した状態で減圧し水分を除去するやつ。蛋白質の変性も避けられるし、得られるものはふわふわの感じで、溶液入れればスって溶ける。なので抗体や精製蛋白質などでは昔からよく使われる。

(無題) 削除/引用 No.3042-2 - 2014/05/17 (土) 15:09:05 - ほし １０M尿素を加える、超音波にかける、pHをアルカリ側にして溶けたら中和する、などが考えられますけど、一部だけが溶けずに残っているのなら、とりあえずそのまま電気泳動にかけてはどうでしょうか？

乾燥させた蛋白の再懸濁方法 削除/引用 No.3042-1 - 2014/05/17 (土) 12:46:57 - Zumi 細胞抽出液の中の蛋白を濃縮させるために遠心バキュームにより、溶液を飛ばし乾燥ペレットにいたしました。それに電気泳動にかけるためにサンプルバッファーを加えたところ、ペレットが浮いてしまい、ボルテックスにかけても完全に溶解しません。乾燥させすぎてしまったためと思いますが、何か溶解させる方法はございますでしょうか？ひとまずは凍結しています。

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