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(無題) 削除/引用 No.3040-13 - 2014/05/18 (日) 21:18:08 - サンショウウオ 　お礼が遅くなってしまい申し訳ありません。 　皆様にいろいろな緩衝液の調製方法をいただいたおかげでいろいろなやり方を知ることができました。ありがとうございます。 　HBSSは手元に調製済みのがあったのでｐH8.3に合わせてみましたが、撹拌中にすぐにpHが戻ってしまったため（即座に密閉容器に移すなら変化は小さそうですが。）、Tris buffered salineを調製してやってみたところ撹拌し続けてもpHが安定していたのでTBSをつかって常温で10分間処理をしようとおもいます。

(無題) 削除/引用 No.3040-12 - 2014/05/18 (日) 02:33:16 - おお >[Re:11] monさんは書きました : > >[Re:9] おおさんは書きました : > > Hanks BSSってSodium bicarbonateが入っているから使いにくくないですか? > そうなんですが、HBSS(+)はD-PBS(-)より安価だったりしますし、また、 > どこまでpHに厳密に調整するかと絡んできますが、TricineのpH調整力？はHBSS中の炭酸bufferより強力なので。 > 炭酸バッファーは外気のCO2濃度とのへいこうできまるので、pHあわせにくいだろうなあと思った次第です。 バッファー効果が強いといっても所詮両方バッファーですから、より強いバッファーをくわえると8.3になるわけではないので、そう言う場合はいちどpHは測ってみるほうがいいとおもいます。そして使うかどうかはどの程度はずれているか、正確性があるかで判断するしかないでしょう。同じようにやれば再現性はあるでしょうから、そういういみではまちがった選択とはいえません。 もしほかの生理的塩濃度バッファーたとえばリン酸バッファー(PBSなど)にTRICINEとかくわえるなら、粉か高濃度TRICINE(中和してない)をくわえてpHを8.3になるまで加えるという手はあるかもしれません。そうするとpH8.3の正確性はたもてます。

(無題) 削除/引用 No.3040-11 - 2014/05/17 (土) 11:07:43 - mon >[Re:9] おおさんは書きました : > Hanks BSSってSodium bicarbonateが入っているから使いにくくないですか? そうなんですが、HBSS(+)はD-PBS(-)より安価だったりしますし、また、 どこまでpHに厳密に調整するかと絡んできますが、TricineのpH調整力？はHBSS中の炭酸bufferより強力なので。

(無題) 削除/引用 No.3040-10 - 2014/05/16 (金) 19:19:00 - けむお 細胞を低pHで刺激するlow ph bufferというもの方法が世の中にはあるのですが、HBSSにHClを加えて作っているみたいです。逆にNaOHを加えればいいのか？でもCO2とかで変化しないのかな。

(無題) 削除/引用 No.3040-9 - 2014/05/16 (金) 12:16:52 - おお >培地やHanks BSSに10-25mM Tricine-HCl（1M stockから）を加えるのが良いと思う。 Hanks BSSってSodium bicarbonateが入っているから使いにくくないですか?

(無題) 削除/引用 No.3040-8 - 2014/05/16 (金) 05:20:27 - mon Trisはミトコンドリアに対して毒性がある（生細胞でも影響があるのかは知らない）、HEPESだと緩衝能範囲をやや超えるので、Tricineかな。10分くらいならTrisでも大丈夫かな？ 細胞を培養するなら、培地成分、とくにMg,Ca,Glucoseを抜くといろいろ起こりそうなので、 培地やHanks BSSに10-25mM Tricine-HCl（1M stockから）を加えるのが良いと思う。この程度の浸透圧上昇は「生存には」問題にならない。 ただし添加後、微妙なpH合わせが必要かもしれない。 Insulin-Trasferrin-Selenium（ITS溶液）（好みで＋0.1~1% BSA）を添加するとなお良いけど、10分くらいなら不要かな。

(無題) 削除/引用 No.3040-6 - 2014/05/15 (木) 17:13:14 - とと pH8.3でラボに普通にありそうなものだと、Trisが第一選択かなと思います。 Tris-bufferd salineのレシピは直ぐ見つかると思います。 PBSにHClとかNaOHでpHを変えるのは緩衝能なくならないか不安です。 ただ、TrisにしろHepesにしろ使う細胞によって毒性があるかもしれないので、確認は必要。 10分程度なら大丈夫かな。 あと、CO2インキュベーターでは使えませんので、あしからず。

(無題) 削除/引用 No.3040-5 - 2014/05/15 (木) 15:06:02 - サンショウウオ あ、書き間違えました、 ☓HEPES 　　↓ ○Tris でした

(無題) 削除/引用 No.3040-4 - 2014/05/15 (木) 15:02:36 - サンショウウオ >>おお　さん 　素早い回答有難うございます。 　なるほど、NaClで浸透圧を合わせれば使えるのですね。 ライフテクノロジーズから出ている１×PBSの組成も参考にして(http://www.lifetechnologies.com/jp/ja/home/technical-resources/media-formulation.158.html) 　PBSのリン酸塩をHEPESに入れ替えて 　155mM NaCl 20mM HEPES 適量　NaOH 　をオートクレーブして使ってみようと思いますが、やはり不安なので意見を伺いたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.3040-3 - 2014/05/15 (木) 14:50:51 - おお 緩衝剤が塩基であれば酸で中和、酸であれば塩基で中和してpHをあわせてください。使う中和用酸、塩基は目的によっていろいろだとおもいますが、NaOHやHClがよく使われます。 どちらを使うかよくわからなかったら、とりあえず緩衝剤をとかして、pHをはかり、上げたかったらNaOHさげたかったらHClを入れればいいです。ややこしくなるのであらかじめ中和された緩衝剤を使わないようにしたほうがいいです。

(無題) 削除/引用 No.3040-2 - 2014/05/15 (木) 14:44:54 - おお 浸透圧はNaClであわせてください。HEPESはちょっと緩衝能力がpH8.3あたりでは弱くないでしょうか。TRISでもpH8.3なら大丈夫です。

ｐH8.3の細胞用バッファーの調製方法 削除/引用 No.3040-1 - 2014/05/15 (木) 14:39:34 - サンショウウオ 　すいません、細胞用培地の作り方でわからないことを質問したくて書き込みます。 　 　最近、細胞の動態解析をしており、10分間ほどpH8.3程度の条件で細胞をインキュベートしたいと考えています。 　普段使っているPBSバッファーでは8.3付近でのpH緩衝能が低いとのことで、TricineあるいはHEPESバッファーを使おうと考えているのですが、細胞に対して浸透圧的に問題ないバッファーの作り方がよくわかりませんでした。（TricineだとSDS用の組成しかネット上で見つけられなかったorz 　いろいろなガイドブックを見て考えたバッファーの組成があるのですが、 　　20mM　Tricine or HEPES NaOH 適量でpH8.3に合わせる 　こういった感じの組成にした場合、細胞をインキュベートすることに用いることは可能でしょうか？ また、この他にもpH8.3で細胞に用いることができるバッファーなどは有りますでしょうか？

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