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(無題) 削除/引用 No.3034-4 - 2014/05/14 (水) 17:22:57 - ~ どのくらい各ステップがきちんと実行されていることを確認されているのでしょうか？ また、トラブルについて再現性は見られるのでしょうか？ 液体培養時のアンピシリンが失活または入れ忘れられていれば、そのような結果が得られてもおかしくありませんよね。 プラスミドが抜け落ちた大腸菌を増やしていれば、菌体量はあるがプラスミドがほとんどない結果が説明できるでしょう。 バンドが見えなくても、わずかに残っていたプラスミドで、PCRなら増えてもおかしくありませんし。

(無題) 削除/引用 No.3034-3 - 2014/05/14 (水) 17:09:17 - pp プラスミドの抽出方法や濃度の測定方法はどのようにしているのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.3034-2 - 2014/05/14 (水) 16:21:05 - AP 直接は関係ないかもしれないが、 >このplasmidをもつ大腸菌をグリセロールstockし、そこから一部を削り取り液体培養してplasmid抽出し、抽出したplasmidをエタ沈してtransfectionに用いています。 グリセロールストックから起こすときは、適当な培地プレート（必要であれば抗生物質や栄養要求性などで選択がかけられるもの）にstreaking （画線培養）してシングルコロニーをピックアップするのが基本。 グリセロールストックは一旦増殖させたものなので、ヘテロな集団になっていると可能性が高く、その中にはプラスミドが落ちたり組換えたりしているやつが混じっているかも。また、アンピシリン耐性菌を液体培養したものをそのままグリセロールストックにしていると思うが、その培養液は分泌されたベータラクタマーゼが含まれているはず。これを直接液体培地に接種したら、アンピシリンが分解されて選択が甘くなるかも。

plasmidのバンドが出ない 削除/引用 No.3034-1 - 2014/05/14 (水) 15:06:41 - はるか plasmidのクローニングについて 生物系の研究室に配属されて二年ほどになる学生です。 現在細胞にtransfectionするためのクローン作製をしているところなのですが、困ったことが起こったので相談させてください。 5kbpのvectorに50bpほどのインサートを組み込んだplasmidを作成しております。 現在ライゲーションし、トランスフォーメーションし、生えてきたコロニーにたいしてインサートを入れた外に設計されているプライマーをつかってコロニーPCRを行い、そのPCR産物をseq.して配列を確認しました。 このplasmidをもつ大腸菌をグリセロールstockし、そこから一部を削り取り液体培養してplasmid抽出し、抽出したplasmidをエタ沈してtransfectionに用いています。 いつもエタ沈後に濃度チェックし、200-300ng程度0.7%または1%アガロースゲルで電気泳動してplasmidを確かめているのですが、今回この電気泳動の際、インサートを組み込んだplasmidのバンドが出ませんでした。 ひとつはバンドらしきものがあったのですがもとのvectorよりはるか上流にぼんやりとしたバンドが出ただけで、目的のバンドとは思えず……。 もしかして別のものを抽出してきているのかもしれない、ともう一度コロニーPCRに用いたプライマーでPCRしてみたのですが、こちらはきちんと目的のサイズのバンドが出ます。（インサートを組み込んだものはその分少し上にバンドが出ます） ベクターにはアンピシリン耐性遺伝子がコードされており、アンピシリン添加培地で液体培養してるのできちんとベクターをもった大腸菌から抽出していると思うのですが……インサート周辺だけが増えてくることはないですよね？ 先輩や先生と相談したりもしているのですが……とりあえず今はplasmid自体をseq.しようと考えています。 原因としてはどのようなことが考えられるでしょうか？ お力を貸していただけると嬉しいです。

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