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(無題) 削除/引用 No.3034-24 - 2014/05/14 (水) 21:34:55 - 中年 寒天培地に楊枝（チップ？）を替えながら段々に希釈してストリークし、最後はシングルコロニーを出すようにして、液培にはそのシングルコロニーから植菌するようにしてください。また、その時、同じプレートに空ベクターのトランスフォーマントを並べてストリークすれば、インサートが大腸菌の生育に悪さをしているかどうかを見ることができると思います。コロニーの形状をよく観察してみてください。

(無題) 削除/引用 No.3034-23 - 2014/05/14 (水) 21:26:18 - はるか たくさんのご指摘ありがとうございます。 返信にかまけるあまりご挨拶が抜けててすみません……。 >[Re:22] elさんは書きました : > LPSのエタノールへの溶解性はそんなに高くないので、エタノール沈殿ではDNAと一緒に沈殿してしまって除けないでしょう。 そうなのですね。 言われるままであまりどう影響するかわかっていなくて…。 出来ればあんまりしたくないですが…（うまくいってる気がしなくて笑） 先生の指示なので一応やっておこうと思います。 > その時は、コンピテント細胞の種類を変えてうまくいきました。 > 理由はわかりませんが、組換えがおこっていたのかもしれません。 > もし、他の大腸菌株（できればStbl系など）を持っていれば、試してみると改善するかもしれません。 研究室にはNEB10βかDH5αしかなく、またDH5αは在庫が切れてしまってしばらくは他ので試せそうにないです……。 どうしてもうまくいかない場合は先生に相談してみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.3034-22 - 2014/05/14 (水) 21:14:46 - el LPSのエタノールへの溶解性はそんなに高くないので、エタノール沈殿ではDNAと一緒に沈殿してしまって除けないでしょう。 特に害はないと思うので、先生が指示するなら従っていた方が無難ですね。 実は、同じような経験もあって、何個かコロニーを拾ってきても、すべて大きい分子量の位置にバンドがでたことがあります。 その時は、コンピテント細胞の種類を変えてうまくいきました。 理由はわかりませんが、組換えがおこっていたのかもしれません。 もし、他の大腸菌株（できればStbl系など）を持っていれば、試してみると改善するかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3034-21 - 2014/05/14 (水) 20:52:45 - はるか >[Re:20] monさんは書きました : > 核酸のODはpHで影響されるので、DDWはお薦めできません（空気中のCO2で酸性になる）。測定するときは、TEでの希釈をお薦めします。 長期保存するものはTEで希釈しているのですが、通常時はDDWでした。CO2まで影響してくるのですね…。 > で、本題ですが、plasmid DNAが大腸菌ゲノムに挿入されている可能性がありそうです。 > plasmidを持っているクローンを拾うため、Ampの濃度を上げて選択した方が良いかもしれません。 plasmid DNAが大腸菌のゲノムに…？勉強不足でぱっとイメージできないのですが、余計なものがとれてきているんですね…。 先の方々にご指摘していただいた通り、寒天培地に広げてから増やしてみようと思います。 液体培地も気になるので新しくしてみます。

(無題) 削除/引用 No.3034-20 - 2014/05/14 (水) 20:31:34 - mon 核酸のODはpHで影響されるので、DDWはお薦めできません（空気中のCO2で酸性になる）。測定するときは、TEでの希釈をお薦めします。 で、本題ですが、plasmid DNAが大腸菌ゲノムに挿入されている可能性がありそうです。 plasmidを持っているクローンを拾うため、Ampの濃度を上げて選択した方が良いかもしれません。 もっともPCR産物をサブクローニングしたほうが早いかも。

(無題) 削除/引用 No.3034-19 - 2014/05/14 (水) 20:06:56 - はるか >[Re:18] ppさんは書きました : > インサート無しは有りより濃度が薄くないですか？ > インサート無しの濃度はバックグラウンドの吸収によるものと考えられないでしょうか． 菌量によるのかもしれませんが濃度に関してはまちまちです。 インサートなしは他の人も使っていますが、なんとなくplasmidがとれにくい、とは話していました。 バックグラウンドの吸収……というと溶かしている溶媒のことでしょうか？ 溶媒はすべて同じ（水）です。 濃度測定は同じblankのときに一緒に測っています。

(無題) 削除/引用 No.3034-18 - 2014/05/14 (水) 20:00:43 - pp インサート無しは有りより濃度が薄くないですか？ インサート無しの濃度はバックグラウンドの吸収によるものと考えられないでしょうか．

(無題) 削除/引用 No.3034-17 - 2014/05/14 (水) 19:53:14 - はるか >[Re:15] ppさんは書きました : > エタ沈後の，nanodrop測定によるインサートありとなしのプラスミドDNA濃度はだいたい同じなのでしょうか． > 蛍光試薬で濃度測定してみたい気がするなあ． 濃度が間違っている可能性はあると思うのですが、何度か同じ日や別の日に測定していて、その間では多少の誤差はあれど大きく変わることはありません。 インサートありなしでは濃度は異なります。（流すときは同じ量（ng）泳動しています） 測定する機械等は他にありません…。 濃度が正しいとすれば電気泳動が不味いのかなと……もう一度流してみようかと思います。

(無題) 削除/引用 No.3034-16 - 2014/05/14 (水) 19:46:24 - はるか >[Re:14] 中年さんは書きました : >プレート上のコロニーのサイズや厚みは、空のベクターのものと比べて遜色無かったですか？たとえば、楊枝などで突っついた時に糸を引いたりしませんでしたか？ 毎回グリセロールストック→液体培養 でプラスミドを回収していたので空ベクターのコロニーは扱っていないのではっきりわかりませんが、インサートについては若干生えてくるのに時間がかかったように思います。 > 見えているバンドは、大腸菌のゲノムDNAのコンタミではないでしょうか。ホストの大腸菌の株は何ですか？（もともとプラスミドを持っている株ですか？） 大腸菌はNEB10βというコンピテントセルです。 もともとプラスミドを持っていないと思っているんですが……調べてみてもよくわかりません。勉強不足ですみません、 もしゲノムDNAだとしたら、電気泳動では出てこないものなのでしょうか…？

(無題) 削除/引用 No.3034-15 - 2014/05/14 (水) 19:36:07 - pp 同じDNA量を解析しているのに，一方はバンドがでて，他方はバンドが出ない． とうことは，DNA濃度が正確でないということでしょうか． エタ沈後の，nanodrop測定によるインサートありとなしのプラスミドDNA濃度はだいたい同じなのでしょうか． 蛍光試薬で濃度測定してみたい気がするなあ．

(無題) 削除/引用 No.3034-14 - 2014/05/14 (水) 19:26:29 - 中年 お書きになっている情報からすると、インサートを持つプラスミドの収量が極端に悪いのだと思います。大腸菌の生育に悪さをするタイプのプラスミドなのではないでしょうか。プレート上のコロニーのサイズや厚みは、空のベクターのものと比べて遜色無かったですか？たとえば、楊枝などで突っついた時に糸を引いたりしませんでしたか？ グリセロールストックをシングルコロニーアイソレーション無しに直接、液培に植菌することは、APさんが既にご指摘になっているとおり、教科書的にはやってはいけない手続きです。 見えているバンドは、大腸菌のゲノムDNAのコンタミではないでしょうか。ホストの大腸菌の株は何ですか？（もともとプラスミドを持っている株ですか？）

(無題) 削除/引用 No.3034-13 - 2014/05/14 (水) 19:09:18 - はるか > →10ng/ugに希釈しPCR > →目的とするバンド(PCR産物)は空ベクター、インサートともにあり すみません記入漏れです 10ng/ulに希釈し、1ul用いているので10ngPCRにかけています。 30cycleあれば目的のplasmidが少量でも含まれていれば増えてきますよね……。 となると、空ベクターではなくまったく別のplasmidも一緒に抽出してきてる、と考えるべきでしょうか…？

(無題) 削除/引用 No.3034-12 - 2014/05/14 (水) 19:01:49 - はるか たくさんのご意見ありがとうございます。 >[Re:10] elさんは書きました : > Nucleo Spinで精製したものをエタノール沈殿する必要性は？ > エタノール沈殿する前のプラスミドを電気泳動した事はありますか？ 同研究室内の他班ではエタ沈なしで使用していますが、私の班では先生からの指示で行っています。 理由は大腸菌のLPSなどが細胞に影響する可能性を除くため精製するとのことでした。 エタ沈前のプラスミドも泳動しましたが、バンドが出ませんでした。 ただ、エタ沈してもOD比がよくなかったり、収量が悪かったり、エタ沈の腕が悪いのかな……と思ってもいます。 >[Re:9] ffさんは書きました : > 電気泳動前の制限酵素処理は書いてないだけ？おこなってない？ 制限酵素処理はおこなっておりらず、そのままplasmidの量を調節して泳動しています。

(無題) 削除/引用 No.3034-11 - 2014/05/14 (水) 18:52:08 - はるか >[Re:8] ~さんは書きました : >インサートを組み込んだplasmidのバンドが出ませんでした。 これから、インサートなしのプラスミドのバンドは出ていたと読み解くのは難しいです。 すみません、読み直したつもりでしたがとてもわかりにくい文章でした……。 少し情報を整理させていただきます。 作製したplasmidをもつ大腸菌から液体培養しplasmid抽出 →250ng, 500ng電気泳動 →空ベクターではバンドあり、インサートではなし →10ng/ugに希釈しPCR →目的とするバンド(PCR産物)は空ベクター、インサートともにあり 目的とするPCRバンドがあるので、目的とするplasmidもあると思っているのですが、plasmidを流した時のバンドが出ないのでこれは一体なにが起こっているのか、というのが疑問になります。 大きすぎて流れてこないor小さすぎて流れ切ってしまう、という可能性も無きにしもあらずなのかな…とも思いますが、空ベクターはきちんとバンドがでますのでよくわかりません……。 ゲルに穴があいているのでは、とも思いますが毎回確認しており大丈夫だと思います。

(無題) 削除/引用 No.3034-10 - 2014/05/14 (水) 18:40:30 - el Nucleo Spinで精製したものをエタノール沈殿する必要性は？ エタノール沈殿する前のプラスミドを電気泳動した事はありますか？

(無題) 削除/引用 No.3034-9 - 2014/05/14 (水) 18:31:52 - ff 電気泳動前の制限酵素処理は書いてないだけ？おこなってない？

(無題) 削除/引用 No.3034-8 - 2014/05/14 (水) 18:05:26 - ~ 個人の操作に問題はなさそうですので、まずはプレートに撒いてそこからコロニーを取ってみるか、 グリセロールストックの作り直しがいいのでしょうか。 >また今回すべて同じように行っているインサートの入っていないプラスミドではバンドが見えます…。 コントロールがあったのですね。 >インサートを組み込んだplasmidのバンドが出ませんでした。 これから、インサートなしのプラスミドのバンドは出ていたと読み解くのは難しいです。 >DNA濃度は10ng/μL バンドがないのですよね。 逆に、その濃度の何のDNAがあると考えているのでしょうか？ 10ng/uLのうちの1/1000が目的のバンドなら、1uL持ち込めば10pgになりますね。 この濃度なら、100uLを電気泳動しても1ngですので、検出限界以下でしょう。 10pgを30サイクル(10^9倍)すれば10mgになりますので、飽和まで増えるでしょう。

(無題) 削除/引用 No.3034-7 - 2014/05/14 (水) 17:45:26 - はるか >[Re:5] qwさんは書きました : > ２）そもそも、コロニーPCRの確認方法に問題は無いのでしょうか？ > あなたのおこなったコロニーPCRでは、空ベクターをもつ大腸菌はPCRされないのですか、それともPCRのサイズでインサートをもつものと容易に区別できるのでしょうか？ > 単にクローニング部位の外側のプライマーでPCRしたのでは、空ベクタとインサート有りを区別できそうにないので、元のプラスミドではPCR出来ないようにプライマーを選択することが必要だと思います。 空ベクターをもつ大腸菌もPCRされるプライマーです。 インサート分(50bp)PCR産物が大きくなるため、それを電気泳動で確認→seqチェックして確認しています。 いつもこの方法で行っているので問題ないかと思っていたのですが……。 インサートが短いのでそこにプライマーを設計するのは難しいのかなと思っているのですが、インサートがある場合だけ増えるプライマーを検討すべきでしょうか。 空ベクターとインサートありを一緒にPCRするとバンドが二本でてしまうので、インサートありだけを取ってきていると思うのですが…。 また、空ベクターを抽出してきているにしても、バンドが全く出ないのでなんでかな、と思います。

(無題) 削除/引用 No.3034-6 - 2014/05/14 (水) 17:34:19 - はるか みなさま、貴重なご意見ありがとうございます。 返信させていただきます。 >[Re:4] ~さんは書きました : > どのくらい各ステップがきちんと実行されていることを確認されているのでしょうか？ > また、トラブルについて再現性は見られるのでしょうか？ どのくらいきちんと実行されているかについてはよくわからないのですが、以前別のプラスミドでも同様の実験を何度か行っておりますが、そのときはバンドも見えました。 また今回すべて同じように行っているインサートの入っていないプラスミドではバンドが見えます…。 トラブルは別のときに抽出したプラスミド二種でバンドが見えないがPCRは成功する、三回目の抽出ではPCRは行っておりませんが、濃度はありますがバンドが見られません……。 液体培地のアンピシリンについては、同じ培地で同様に実験している他の方はきちんとプラスミドがとれているようですので働いているかと…。 もしアンピシリンが失活している場合には、大腸菌自体がもっているプラスミドがとれているということでしょうか？ PCRをかける際、DNA濃度は10ng/μLまで希釈して用いているのですが、その中のわずかな目的のプラスミドからでも増えてきますでしょうか……。 単純に操作の問題も考えられるのですが、別のプラスミドではきちんとできるのでプラスミド自体の問題もあるのかもしれないと考えています…。 >[Re:3] ppさんは書きました : > プラスミドの抽出方法や濃度の測定方法はどのようにしているのでしょうか。 プラスミド抽出亜は市販の抽出キット(Nucleo spin plasmid)を使用しています。 濃度測定はNanoDropで行っています。 >[Re:2] APさんは書きました : > グリセロールストックから起こすときは、適当な培地プレート（必要であれば抗生物質や栄養要求性などで選択がかけられるもの）にstreaking （画線培養）してシングルコロニーをピックアップするのが基本。 先輩方から教わった方法はまっすぐ液体培養だったのでコロニーをピックする方法はやったことがありませんでした。検討します。

(無題) 削除/引用 No.3034-5 - 2014/05/14 (水) 17:23:50 - qw １）APさんの指摘とかぶりますが、大腸菌としてシングルクローンを拾っていないのではないでしょうか？ コロニーPCRして、思ったような結果が得られたとしても、思っていないような大腸菌が混ざっていないことを否定できません。 トランスフォームした大腸菌のコロニーを一つ一つ拾って、別々にプラスミドを調製し、そのプラスミドに50bpのインサートがあることを確認する必要があります。 ２）そもそも、コロニーPCRの確認方法に問題は無いのでしょうか？ あなたのおこなったコロニーPCRでは、空ベクターをもつ大腸菌はPCRされないのですか、それともPCRのサイズでインサートをもつものと容易に区別できるのでしょうか？ 単にクローニング部位の外側のプライマーでPCRしたのでは、空ベクタとインサート有りを区別できそうにないので、元のプラスミドではPCR出来ないようにプライマーを選択することが必要だと思います。 まあ、シーケンスで入っていることを確認するのも一つの方法ではありますが、余り良い方法だとは思いません。いずれにしても単一のプラスミドを持つ大腸菌を用意する必要があります。

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