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(無題) 削除/引用 No.3030-12 - 2014/05/20 (火) 17:44:39 - ぽん とおりがかりの者です。 膵島とかだと、粗い単離後のHBSS(-)に2mMになるようにEGTAを添加して、37℃15分間インキュベートするとキレイにバラバラになります。 細胞培養用のトリプシン-EDTAよりもむしろ良い印象です。 他にDispaseという酵素を用いるとキレイにできるそうですが、ぼくは使ったことがありません。 見当違いのコメントでしたらごめんなさい。

(無題) 削除/引用 No.3030-11 - 2014/05/15 (木) 21:33:36 - まこ 日本語が変でした。正しくは次です。 ”組織にも使えると書いてあるように、使用できます”

(無題) 削除/引用 No.3030-10 - 2014/05/15 (木) 20:36:24 - まこ レスをいただいた皆様、どうもありがとうございます。 ミリポアに聞いたところ、 ”当該ウェブに It can be used to dissociate primary cells, tissues, and tumors with an increased plating efficiency. と書いてあるように組織にも使える、と書いてあるように使用できます” という回答を得ました。そのため、ちょっと試してみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.3030-9 - 2014/05/14 (水) 08:40:24 - mem > 比較的に硬い組織の中に存在する細胞のために、コラゲナーゼ処理だけの場合、細胞収率がとても低いと感じています。 > また可能なら、すぐにフローサイトにかけて、できるだけ生体に近い状態で、膜タンパクの量を解析したいと考えています。 酵素で切断されたタンパク質がどのくらい早く取り込まれるかによりますが、酵素処理を短時間で行い、急冷、固定、膜透過処理をして細胞内ドメインに対する抗体を用いれば、酵素で分解された膜タンパク質でもフローサイトで検出できるかもしれません。 > 細胞外マトリックスへの接着が強そうなので、memさんの御意見をふまえて考えますと、Cell Dissociation Bufferはあまり有効では無さそうです。 やってみる価値はあると思うので、サンプルをもらえないか交渉してみて、いろいろな酵素と一緒に試してみて、適しているのを探してみるのが近道だと思います（予算に余裕があれば、全部買ってもいいですが）。

(無題) 削除/引用 No.3030-8 - 2014/05/13 (火) 13:20:38 - ~ これまでに効率よく回収された報告のない細胞を回収しようとしているのでしたら、 それだけで一テーマになるくらい時間と労力がかかるかもしれません。 その固い組織は何でできているのでしょうか。 その構成物を分解できる酵素（またはケミカル）が有効なのでは？ また、細胞によっては遊走する性質があるものもありますので、 その場合は適当に物理的にミンチにした組織をディッシュ等の上におき、 ディッシュ側に移った細胞をスクレーパーで掻き取る方法等もありうるのでは？

(無題) 削除/引用 No.3030-7 - 2014/05/13 (火) 12:14:59 - まこ さっそくの情報や御意見を誠にありがとうございます。 説明不足の点、補足します。 比較的に硬い組織の中に存在する細胞のために、コラゲナーゼ処理だけの場合、細胞収率がとても低いと感じています。 また可能なら、すぐにフローサイトにかけて、できるだけ生体に近い状態で、膜タンパクの量を解析したいと考えています。 細胞外マトリックスへの接着が強そうなので、memさんの御意見をふまえて考えますと、Cell Dissociation Bufferはあまり有効では無さそうです。

(無題) 削除/引用 No.3030-6 - 2014/05/13 (火) 10:24:11 - おお 目的の細胞や組織を差し支えなければ明示すれば、もう少し情報が得られるのではないでしょうかねぇ。。。

(無題) 削除/引用 No.3030-5 - 2014/05/13 (火) 09:12:55 - ~ >たとえば、次のような商品はトリプシンの代わりにならないでしょうか？ 使う酵素で細胞が取れたり取れなかったりすることがありますので、 代わりになるかはやってみないと分からないかと。 コラゲナーゼの他には、神経細胞用にパパインが使われることはありますね。

(無題) 削除/引用 No.3030-4 - 2014/05/13 (火) 08:01:29 - mem 初代培養細胞の解析が目的なら、1日くらい培養すればトリプシンなどで分解されても発現量が高いタンパク質なら解析に問題ないくらい戻ると思いますが。 バラバラにした時点からそのタンパク質の機能を追っていきたいとか、培養した細胞を剥がしてフローサイトで解析したいとかの場合には、トリプシン以外の酵素が必要になりますね。 トリプシン以外のマイルドな酵素としては、Dispase、Accutase、Accumax、TrypLE　Expressなどが挙げられますが、酵素である以上目的のタンパク質を分解する可能性があるので、Western Blottingなどで予め分解されるかどうかを確認する必要があります。 また、collagenaseも粗精製品だとトリプシン様の活性が混入していることがあるので、トリプシンインヒビターを添加したほうがよいです。 Cell Dissociation BufferはEDTAなどを添加したキレート剤のバッファーです。細胞間接着も細胞外マトリックスへの接着も、弱い相互作用ならバラバラにできますが、全然剥がれない細胞の方が多いように思います。酵素不含といっても、二価カチオンが無い状態にさらされるので、長期間作用させると細胞の生存率は下がってしまうでしょう。

(無題) 削除/引用 No.3030-3 - 2014/05/13 (火) 07:49:17 - alpha 対象にされている細胞にもよりますが、コラゲナーゼ処理した状態でも培養できる細胞はあると思いますよ？ 私はどうしても細胞が欲しいときは、ディスパーゼで処理しています。 まこさんの仰るように、膜抗原が傷つくので、極力避けたいですが…

(無題) 削除/引用 No.3030-2 - 2014/05/13 (火) 04:25:24 - おお コラゲナーゼ処理した状態では培養できませんか?

トリプシンを用いずに組織から初代細胞調整は可能？ 削除/引用 No.3030-1 - 2014/05/13 (火) 01:41:26 - まこ どうぞよろしくお願いします。 初代培養用の細胞を調整する目的で、普段はコラゲナーゼ処理をした後の組織に対して、トリプシン処理をしています。 しかし、これから、ある膜タンパクの研究を開始したく、そのために、トリプシンなどの膜タンパクを切断するような酵素を用いない、初代培養用の細胞を調整法がないかと困っています。 なにか御存知の方がいらっしゃれば、どうぞよろしくお願いします。 たとえば、次のような商品はトリプシンの代わりにならないでしょうか？ Enzyme Free Cell Dissociation Solution PBS Based (1X), liquid 　www.millipore.com/catalogue/item/s-014-c

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