全6件 ( 1 〜 6 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.3023-6 - 2014/05/10 (土) 20:04:33 - Harmonia ちょっと気になったのは、お考えの方法でできたラダーは１レーンで流すの ですよね？ RIのキットだと、４種類のラダーができて４レーンで流す。 だから、どのバンドが配列のどれかは明確ですが、１レーンで流すと、 どのラダーが何番目なのか、どうやって確認をするのでしょうか？ プライマーのみのレーンを作って、それを基準にすれば良いのだとは理解 できますが、実践的には「何個目のバンドがこの塩基」と言いきるのに 不安が有ります。 また、ddNTPの配合比率が同率でないなら、各バンドの強さが同じにはなら ないですね。

(無題) 削除/引用 No.3023-5 - 2014/05/10 (土) 15:19:52 - 中年 やったことはないのですが、BigDye Primerのキットなら行ける気がします。でも、dyeによって蛍光収率が違うでしょうから、４つのレーンを等量流しても同強度のラダーにはならないかもしれません。また、32Pの崩壊によって生じた32Sが、揮発性の化合物を生じるかもしれないので、換気には気を付けた方が良いと思います。

(無題) 削除/引用 No.3023-4 - 2014/05/09 (金) 22:36:53 - mon 参考までに、キュピラリー電気泳動では蛍光色素のついたDNAは無標識DNAと泳動度が変わるので、RIラベルの断片と比較できません。 役立たずで申し訳ありませんが、PAGEだとどうなのかは知りません。 なお、キュピラリー電気泳動では、同じ塩基長でも4色のdyeで泳動度が異なるので、ベースコールするときにそれぞれの泳動度を補正しています。

(無題) 削除/引用 No.3023-3 - 2014/05/09 (金) 21:44:03 - AP マクサム・ギルバート法でラダーを作るという方法もある。

(無題) 削除/引用 No.3023-2 - 2014/05/09 (金) 21:39:52 - AP 質問の答えではないけれど >（この解析はmRNAの5'端ではなく、内部で逆転写が停止しやすいところを調べるのが目的です） primer extensionで、どうしてこういうことが調べられるのかが理解できません。 伸長の向きは、鋳型RNAに対して上流に行くわけですよね。 S1 mappingでなら可能ですが。

BigDyeキットで32Pラベルのシークエンス 削除/引用 No.3023-1 - 2014/05/09 (金) 20:25:54 - DSC タイトルのとおりです。 Primer extension assayのマーカーとしてシークエンスラダーが必要です。 本来なら、アイソトープラベル用のシークエンシングキットを用いるか、プロトコール本どおりに自前でdNTPとddNTPを混ぜて反応すればよいのでしょうけど、できれば新しい買い物をせずに済ませたいと思っています。 32Pで5'ラベルしたプライマーを用いて、BigDye Primerのキットで反応すれば、イメアナ等で検出可能なきれいなシークエンスラダーを作れるでしょうか？ 鋳型には、Primer extensionで解析する領域を含むRT-PCRプロダクトを用いるつもりです。 （この解析はmRNAの5'端ではなく、内部で逆転写が停止しやすいところを調べるのが目的です） プライマーは、もちろん解析用と同じものを使います。 試せば済む話なんですけど、、、 ご経験のある方とかおられたら、情報をお願い致します。

全6件 ( 1 〜 6 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---