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翌日noExosap処理 トピック削除
No.3018-TOPIC - 2014/05/08 (木) 00:01:51 - exo
よろしく御願いします。

300bp程度のPCR増幅産物をBig Dye Terminatorでシーケンスするため、Exosap処理をしています。
PCRを実施しなければいけない数が多いため（96ウェルプレートで５枚/日、同日にアガロース泳動）、
Exosap処理は翌日になってしまう計画が今後あります。

泳動用に少し反応液をとった後の96ウェルプレートを冷蔵庫でオーバーナイト保存したいと考えて
います。安心のために、TEをPCR反応液の10分の１ぐらい入れた方が良いかなと考えています。

御意見をいただきたいのは、翌日に実施するExosap処理に、10分の１TEは悪影響するでしょうか？
またシーケンス反応に悪影響するでしょうか？
、

なお、PCRはタカラのTks Gflexで、シークエンス反応は次です。

2.0μlのBig Dye Sequencing Buffer
3.2ulのプライマー1pmol/ul
PCR 産物 5-10ng
4.0μlのプレミックス(BigDye Terminator v3.1Cycle Sequencing Kit) 　
滅菌水にて　計20μlにメスアップ
　
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(無題) 削除/引用
No.3018-7 - 2014/05/08 (木) 16:54:10 - 中年
いわゆるTEに含まれるEDTAは 1 mMなので、1/10 volのTEを加えたところで、Mg2+の濃度はほとんど変わりませんよ。Mg2+をキレートしてDNaseを阻害しようと考えておられるなら、PCRのバッファーに含まれている分をキレートできるだけのEDTAを加えないと意味がありません。

そんなにDNaseのコンタミが心配なのであれば、翌日まで凍らせておいたらどうですか？

(無題) 削除/引用
No.3018-6 - 2014/05/08 (木) 16:48:38 - 7744
おそらく入れなくても問題ないと思う。
泳動時にコンタミするかもというのが心配なら、一日目はPCRをかけるとこまでやって、二日目に電気泳動以降全てやればいいのでは？

それに、300bpの９６ウェル５枚分程度なら、たぶんサーマルサイクラー１台でも半日でPCRからexoSAP処理まで終わる気が・・・

(無題) 削除/引用
No.3018-5 - 2014/05/08 (木) 16:10:57 - exo
作業の流れがつぎのため、泳動の前後でDNA分解酵素がコンタミする可能性を危惧しています。

（１）PCR
（２）PCRと同日に増幅産物の一部を泳動
（３）翌日、残った増幅産物をExosap処理
（４）シーケンス

(無題) 削除/引用
No.3018-4 - 2014/05/08 (木) 16:08:07 - exo
Es様
EDTAを入れると、もしコンタミしたDNA分解酵素が存在しても、シーケンスの鋳型が無事になるのではないかと考えています。

またEDTAが、Exoの酵素反応やシーケンスに悪影響しないかということを危惧しています。

(無題) 削除/引用
No.3018-3 - 2014/05/08 (木) 14:16:15 - Es
TEを入れると安心、という部分が、どういう理由で安心なのか今ひとつ理解できていませんが、、、

> 翌日に実施するExosap処理に、10分の１TEは悪影響するでしょうか？
> またシーケンス反応に悪影響するでしょうか？
どちらも心配ないと思います。

PCRを仕掛けて帰宅→4℃ holdでオーバーナイト→翌日、ExoSAP処理〜シークエンス反応、というのでも問題ありませんので、TEを入る必要は無いように思いますが。

翌日のExosap処理のために10分の１TEを入れるべきか 削除/引用
No.3018-2 - 2014/05/08 (木) 00:03:34 - exo
途中で送信してしまいました。正しいタイトルは
　　翌日のExosap処理のために10分の１TEを入れるべきか
です。

翌日noExosap処理 削除/引用
No.3018-1 - 2014/05/08 (木) 00:01:51 - exo
よろしく御願いします。

300bp程度のPCR増幅産物をBig Dye Terminatorでシーケンスするため、Exosap処理をしています。
PCRを実施しなければいけない数が多いため（96ウェルプレートで５枚/日、同日にアガロース泳動）、
Exosap処理は翌日になってしまう計画が今後あります。

泳動用に少し反応液をとった後の96ウェルプレートを冷蔵庫でオーバーナイト保存したいと考えて
います。安心のために、TEをPCR反応液の10分の１ぐらい入れた方が良いかなと考えています。

御意見をいただきたいのは、翌日に実施するExosap処理に、10分の１TEは悪影響するでしょうか？
またシーケンス反応に悪影響するでしょうか？
、

なお、PCRはタカラのTks Gflexで、シークエンス反応は次です。

2.0μlのBig Dye Sequencing Buffer
3.2ulのプライマー1pmol/ul
PCR 産物 5-10ng
4.0μlのプレミックス(BigDye Terminator v3.1Cycle Sequencing Kit) 　
滅菌水にて　計20μlにメスアップ
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