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(無題) 削除/引用 No.3017-21 - 2014/05/11 (日) 10:14:40 - おお まあ返事こないから困ってたんでしょうけど(てかあまり隅々までよんで判断してないで書いてるので一般的な話をしただけですけど)、なんていうか対応の仕方が下手というかきっちりしてないというか。 メールで問い合わせするなら、この組成でけいだいする予定でいます、何か不備などがあればご連絡くださいとか書いておけば、メールがなければそのままその通りにやるという意思表示になりますし、もっとスムーズだったかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3017-20 - 2014/05/11 (日) 08:33:40 - 身近な話 >[Re:19] 身近な話さんは書きました : > >また、近所のラボの培地は、そのラボの研究目的に合わせて作っています。 > 教員同士が師弟関係や同門関係で近いテーマを行っているのでなければ、同じ組成であることは期待できないでしょう。 > > そうなのにここで全く関係無い人がネット上でアドバイスする無責任さよ。 >[Re:19] 身近な話さんは書きました : > >また、近所のラボの培地は、そのラボの研究目的に合わせて作っています。 > 教員同士が師弟関係や同門関係で近いテーマを行っているのでなければ、同じ組成であることは期待できないでしょう。 > > そうなのにここで全く関係無い人がネット上でアドバイスする無責任さよ。 確かに身近な話さん(同じHNですね。私は別トピでは粘着してるとか言われてしまう位で、簡潔に書けずどうしても長くなってしまいます)の言う通り無責任といえばそういえるのかわかりません。でも、(不完全な)指示だけ出して出張に行ったりする上司は結構いるものです。それでいてやらなきゃならない作業は待ったなしの場合は、別ラボやネットからの情報が非常にありがたかったりすると思いますよ。 最終的にReihoさんがどうやって継代したかわかりませんが、どうやったかの記録をきちんと取っておいて、上司が帰ってきたらそれをありのまま報告すれば良いと思います。上司のやり方に沿わない点があったら、その点言ってくれるでしょう。 ぶっちゃけて言ってしまうと、どんなやり方でやってもそれほど結果に差は出ないと思います(あ、トリプシンはそうでもないか)。このトピ内でも話に出たように、50mlを抜く人抜かない人がいるわけで、でも、論文になる時は皆10%serumを使ったと書くと思います。しかし、とみさんやmemさんが仰るように、ラボのやり方に従うというのは(特に、自分で判断が出来ないB4学生や実験補助レベルの方にとって)非常に大切なことです。

(無題) 削除/引用 No.3017-19 - 2014/05/10 (土) 22:03:06 - 身近な話 >また、近所のラボの培地は、そのラボの研究目的に合わせて作っています。 教員同士が師弟関係や同門関係で近いテーマを行っているのでなければ、同じ組成であることは期待できないでしょう。 そうなのにここで全く関係無い人がネット上でアドバイスする無責任さよ。

(無題) 削除/引用 No.3017-18 - 2014/05/09 (金) 18:58:24 - ~ >[Re:16] おおさんは書きました : > ラボの流儀だったらまあ仕方がないですねぇ。。。大丈夫だからと無理に変更させるのもどうかと、、、無血清の培地をよくトランスフェクションでつかうので、そうやってキープするというひともいるようです。 あ、ボスの意向と書いてありますね。 Final 500mLになるように濃度計算をするために抜いたのと勘違いしていました。 解決したように書かれていませんが、継代できたのか、月曜日まで放置なのか、土日に指示が届いて継代することになるのか…

(無題) 削除/引用 No.3017-17 - 2014/05/09 (金) 13:40:36 - mon よっぽど大量に培地を使うのでなければ、Hygromycinはボトルではなく使用するdishの培地に必要量をピペットマンに入れた方が良いでしょう（今回は1/500量：20uL/10mL培地ですね。ただしあくまでもラボの方針による）。 これは、培地（ボトル）の冷蔵・加温等によるHygromycinの不活性化を防ぐためです。 Penicillin/Streptomycinはある意味気休めなので、失活とか気にせず培地ボトルに1/100量添加しています。

(無題) 削除/引用 No.3017-16 - 2014/05/09 (金) 11:13:19 - おお >ただ、500mL入りのDMEM培地ボトルから培地を50mL捨てるラボは多くはないと思います。 ラボの流儀だったらまあ仕方がないですねぇ。。。大丈夫だからと無理に変更させるのもどうかと、、、無血清の培地をよくトランスフェクションでつかうので、そうやってキープするというひともいるようです。 でたんに計算が出来ないというはなしなんでしょうかねぇ。。。

(無題) 削除/引用 No.3017-15 - 2014/05/09 (金) 09:49:28 - ~ 2日間メールの返事がないのでしょうか？ そろそろ連絡がついてもいいと思いますが。 #13で計算上はあっています。 ただ、500mL入りのDMEM培地ボトルから培地を50mL捨てるラボは多くはないと思います。 体積変化を気にしなかったり、培地500mLを固定でそこから他の試薬の添加量を計算するラボもあります。 その場合でも、とりあえずは細胞が死ぬほどの組成の変化はないとは思いますが… それよりも、継代の指示から2日経っているため、今から継代して細胞が維持できるか心配です。 また、近所のラボの培地は、そのラボの研究目的に合わせて作っています。 教員同士が師弟関係や同門関係で近いテーマを行っているのでなければ、同じ組成であることは期待できないでしょう。 さらに、実験補助者は学生と異なり”近所のラボの教授の講義を受けた関係”を使えません。 そのため、ボスに無断で他ラボの資産を分けてもらう場合は学生以上に注意が必要です。

(無題) 削除/引用 No.3017-14 - 2014/05/08 (木) 22:10:17 - rg めちゃくちゃやな。 近所のラボに駆け込んで、緊急措置としてそのラボで使っている培地とかもらってきなさい。そして教授が帰ってきたら、自分のメモの取り方のマズさと無知さを白状してキチンと教えてもらいなさい。傷口が広がりまくっているだけだ。

(無題) 削除/引用 No.3017-13 - 2014/05/08 (木) 15:53:43 - Reiho >皆様 色々とご教授頂き、改めて組成式を立ててみました。 確認の程宜しくお願い致します。 【目的濃度】 1) DMEM + Penicillin(100units/ml) + Streptomycin(100μg/ml) 2) DMEM + FBS(10%) + Penicillin(100units/ml) + Streptomycin(100μg/ml) 3) DMEM + FBS(10%) + Penicillin(100units/ml) + Streptomycin(100μg/ml) + Hygromycin B(100μg/ml) 【研究室ある試薬類】 ◎DMEM 500ml / 液体 ◎FBS 50ml / 非働化済 ◎P/S (10,000units Penicillin;10,000μg Streptomycin) ◎Hygromycin B　（1g/20ml） 　　 　　↓ 【組成式】 1) DMEM:495ml + P/S:5ml 2) DMEM:445ml +FBS:50ml + P/S:5ml 3) DMEM:445ml +FBS:50ml + P/S:5ml + Hygromycin B:1ml でよろしいのでしょうか。 どうぞ宜しくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.3017-11 - 2014/05/08 (木) 15:46:46 - Reiho >>【~様】、【mem様】 Penicillin(100units/ml)とStreptomycin(100μg/ml)が最終濃度にしなければならないことを間違えていました。 最終的な培地を500mlのボリュームで作るので、ほかに何を入れようともP/Sは5ml必要になりますね。 気づかせていただきありがとうございました。 ただHygromycin Bの添加量が分かりません。 最終濃度は100μg/mlにしたいと言われています。 500mlボリュームで作るとなると、50mg分入っていればいいので (1g/20ml)のHygromycin B溶液を1ml分入れれば良いという計算であってますでしょうか。 宜しくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.3017-10 - 2014/05/08 (木) 15:24:45 - Reiho >>【ho様】、【qw様】 研究室にある試薬を探してみたところ、以下の試薬がありました。 http://www.atcc.org/Products/All/30-2101.aspx#generalinformation これを分注してそのまま使えば"0.25% Trypsin/0.53 mM EDTA "になって、問題はありませんよね？ >>【ema様】、【おお様】 培地はsigma社のDMEM 500mlを用いております。 教授の意向で培地作成時に50ml分は抜いているのですが、配分は私が書いたもので間違いないですか？ またピペットマンがありますため、Hygromycin Bの添加は安心して行えます。 溶液と溶媒の関係でピペッティングさえすれば、全体に溶けるはずですよね。 またトリプシンは研究室にhttp://www.atcc.org/Products/All/30-2101.aspx#generalinformationがありました。 これはPBSで溶かさず、このまま濾過フィルターに通せば問題なさそうですか？ >>【とみ様】 とみ様の仰る通りです。 普段は教授に質問しながら、実験を進めています。 コメント頂きありがとうございました。 皆様、ご回答いただきありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.3017-9 - 2014/05/08 (木) 15:00:58 - mem 一番良いのは、ボスに聞く事。 次に良いのは、ラボの他のメンバーに聞く事。 一番悪いのは、勝手にやる事。 次に悪いのは、ここで聞く事。 培地の組成はラボの流儀があって、450mlの培地に50mlの血清を入れるところもあれば、500mlの培地に50mlの血清を入れるところもある。この位の違いはそこまで問題にはなりません。ここで聞いても異なる方法がいろいろと出るだけで、混乱するだけです。ラボのやり方に従うべきです。 記載されている内容で気になるのは、hygromycinとP/Sの濃度計算。明らかに違いますよ。 あと、通常の培養でピルビン酸とNEAAを使っているなら、入れないとだめでしょうね。 DMEMといっても、組成が少しずつ違う物もひっくるめてなので、ボスはピルビン酸とNEAA入りを前提にしている場合もあります。 ネットの情報に頼ったり、自分勝手にやるよりも、わからないことはちゃんと聞いてラボの方針に従う方が、普通はボスの心象はよいはずです。

(無題) 削除/引用 No.3017-8 - 2014/05/08 (木) 13:38:33 - ~ >実際に作る時は2),3)はDMEM:449ml、FBS:50mlでやろうと思いますが、組成式自体は間違えてないでしょうか。 「 Penicillin-Streptomycin, Liquid (10,000units Penicillin;10,000ug Streptomycin) 」の100mlボリューム の各数値は濃度(units/mL, ug/mL)で、ペニシリン濃度は�@10,000 units/mLですよね？ ターゲットは 1) DMEM + Penicillin(100units/ml) + Streptomycin(100ug/ml) で、�A100units/mLですよね。 ペニシリン10,000 units/mL溶液　 1mL 溶媒　　　　　　　　　　　　　449mL を足すと450倍に希釈されますよね。 �@を450倍しても、�Aの濃度になりませんが、他の濃度に影響する因子があるのでしょうか？ 私の勘違いであればいいのですが、とりあえず今の時点で雇い主に計算方法を聞くことはお勧めできません。 せめて他人が分かるように濃度計算の説明ができないと、職務遂行能力が疑われます。 学生さんならば疑われてもいいのですが、実験補助をされているのでしたら、契約に影響するかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3017-7 - 2014/05/08 (木) 11:51:56 - おお だれか研究室でけいだいしている人いないんでしょうかねえ。。。そう言う人にきく方がいいとは思いますけど。

業界でも 削除/引用 No.3017-6 - 2014/05/08 (木) 06:52:33 - とみ 実験補助なら心して聞いて欲しいが、わからないことがあったらちゃんと雇い主の教授に聞きなさい！ それぞれの研究室ではそれぞれのやり方があったりしますし、勝手にやることを嫌います。 それが常識！ほかの業界でも、上司に聞くのが普通でしょ？

(無題) 削除/引用 No.3017-5 - 2014/05/07 (水) 23:47:46 - おお 500mlのボトルに50mlの血清をいれてさらにPSを入れてます。ユニット数は覚えてませんが、x100のPSを使っているのでPSは5ml加えてます。 ハイグロは最終濃度はものによって違うかもしれませんので何ともいえませんが、上記のようにつくった培地にさらに加えています。ボリュームは500mlとして計算しています。正確ではありませんが。毎回そうすることで同じ培地が作れるのでそう言う意味では再現性は確保できると。ただこれぐらいのぶれで細胞の増殖が大きく変わるとかまずないので、 トリプシンはPBSにとかしてください。少なくとも浸透圧が保てるよう0.9%ぐらいの塩濃度が必要です。溶解後はフィルター滅菌です。

培地の答えがないようなので 削除/引用 No.3017-4 - 2014/05/07 (水) 21:57:01 - ema 培地DMEMは粉からとかしているのでしょうか？500mlボトルを購入しているのでしょうか？ 厳密にはReihoさんの配分かと思いますが、買っている場合には余った分を分注する手間もあるので、500mlのボトルに55mlのFBS、PS1.1mlで入れてもいいです。（ボトルからあふれることはありません） 粉から溶かす研究室であれば、（あまりやったことが無いかもと老婆心）DMEM作成時にｐHを合わせ、0.22umフィルターをかけて滅菌したガラス瓶等に分注しFBSとPS HygBを入れてください。 Hygromycin Bの転嫁は1mlとかの”ピペット”ではなくピペットマンを使用すれば問題ないと思います。（研究室にありますか？） 0.25% trypsin/0.53 mMEDTA solution 研究室ではよくまとめ買いをして-20℃にストックされていて、使うボトルだけ４℃に置くものなのでよかったら研究室をさがしてみてください。

(無題) 削除/引用 No.3017-3 - 2014/05/07 (水) 20:32:34 - qw PBSでTrypsinを溶解するのだとばかり思って（そうして）いたのだけど、0.53mM EDTAで溶かすだけでホントに良いのかね？ 実験補助とのことですから、市販品の細胞分散用の0.25% Trypsinを買われる方が宜しいのではないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3017-2 - 2014/05/07 (水) 20:14:29 - ho 恐らく0.25% Trypsin/0.53 mM EDTAの事かと思うのですが・・・。 Trisを入れるプロトコールもあるのでしょうか。 通常0.25% Trypsin/0.53 mM EDTAであれば、0.25% Trypsinとなるように 0.53 mM EDTA を使って溶液を調製するだけです。あとはシリンジフィルターなりで滅菌を。

細胞培養で用いる培地組成/Trypsin作製法を教えてください 削除/引用 No.3017-1 - 2014/05/07 (水) 18:54:04 - Reiho 私、とあるラボで実験補助をしております。 細胞培養のバックグラウンドが乏しいため、レベルの低い質問であることご容赦ください。 本日ラボに行くと教授より以下の培地を用いて継代を行ってみてくださいとメモ書きがありました。 1) DMEM + Penicillin(100units/ml) + Streptomycin(100µg/ml) 2)　DMEM + FBS(10%) + Penicillin(100units/ml) + Streptomycin(100μg/ml) 3) DMEM + FBS(10%) + Penicillin(100units/ml) + Streptomycin(100μg/ml) + Hygromycin B(100µg/ml) 研究室にあるP/S試薬は「 Penicillin-Streptomycin, Liquid (10,000units Penicillin;10,000µg Streptomycin) 」の100mlボリュームです。 またHygromycin Bは1g/20mlがあります。 上記培地を作製するのであれば、それぞれの量は、 1) DMEM:449ml + P/S:1ml 2) DMEM:449.1ml +FBS:49.9ml + P/S:1ml 3) DMEM:449.1ml +FBS:49.9ml + P/S:1ml + Hygromycin B:2µl でよろしいのでしょうか。 実際に作る時は2),3)はDMEM:449ml、FBS:50mlでやろうと思いますが、組成式自体は間違えてないでしょうか。 また500mlものボリュームで作る際に2µlのHygromycin Bだと少々不安が残ります、良い方法はないでしょうか。 なお今まで用いていた培地はDMEM:430ml、FBS:50ml、Sodium Pyruvate(100mM):5ml、MEM NEAA(100x):5mlを混ぜて使っていました。 また継代の際に細胞はがす為のTrypsin溶液がもう無くなってしまい、新たに作ろうにも組成が分かりません。 "0.25% trypsin/0.53 mM Tris-EDTA solution"と自分の実験ノートに書いてはいるのですが、何をどうすればよいのか分かりません。 0.25%に希釈すればいいのか、また0.53mMとは何なのか混乱してしまっています。こちらも教えていただければ幸いです。 教授は現在海外出張中で、メールへの返事も現在のところない状況です。 どうぞ宜しくお願い致します。

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