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(無題) 削除/引用 No.3010-7 - 2014/05/01 (木) 15:30:19 - western 詳しい回答ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.3010-6 - 2014/05/01 (木) 01:00:11 - み 抗原ペプチドで消えたからといっても目的の蛋白の分解産物とは限らない。 ｴﾋﾟﾄｰﾌﾟと似た構造をもつ全く別の蛋白にクロスリアクトすることも多々ある。 細胞ならノックダウンで確かめるべきかな。 あと免疫沈降できる抗体なら落ちるか試すとよい。 このとき最低限、推定サイズの蛋白は落ちる抗体でないと話にならないが。

(無題) 削除/引用 No.3010-5 - 2014/04/30 (水) 20:53:10 - 名無し いくつか可能性が挙げられるとおもう。 ひとつは、full lengthのどっかが切れて分子量が小さくなったformが出来て、でもその配列の中にエピトープとなる配列がまだ含まれていれば反応する。問題はいつ切れたで、もともと細胞中でその蛋白質の何％かはそういう限定分解を受けるのかものなのか（生理的に意味のあるもので、重要な発見と思う）、それとも抽出過程や保存中に偶発的に起きたものなのか（アーティファクト）ということだわ。細胞の状態や刺激などと対応して出現するようなら前者、出たり出なかったり、保存期間に比例して増えたりしてたらたぶん後者とおもう。 ソにケーションはどうしても暖かくなるからね、buffer組成がマイルドだと、いろいろやってる間に酵素がじわじわ働いてしまう恐れはあるね、実験目的からみてもし問題ないならばSDS-sample buffer（+インヒビター 、BPBなし、bMEなし）で直接細胞とかして（この溶液の中ではたいていの酵素は失活する。もちろん例外もあるんだけど稀ケース）それでソにケーションすればいいかもしれない。BPBとbMEは蛋白質濃度定量のあとで入れる。あと蛋白質濃度の定量法はSDS含むサンプルに使えるのと使えないのがあるので注意。 IPができる抗体ならIPして、低分子量側のポリペプチドがうまく捕まえられて（ほんのわずかでもクマシーで染まるならば量的にはOK）それ切り出して、トリプシン消化して、LC-MS/MSで分析して配列明らかにすれば全て解決するとおもう。

(無題) 削除/引用 No.3010-4 - 2014/04/30 (水) 14:12:11 - western 回答ありがとうございます あさん 予想される分子量というのはアミノ酸配列から予想される分子量で、抗体のデータシート、またそれを用いた論文でバンドが出るとされている分子量です。 おおさん あらゆる可能性が考えられますよね... 論文中ではライセートの調製にhomoginatedとだけ書かれていたので、以前私自身が行っていたソニケーションによる調製を行っていたのですが、よりマイルドな調製方法を試してみることにしました(とりあえず...)。

(無題) 削除/引用 No.3010-3 - 2014/04/30 (水) 13:40:57 - おお たんなるノンすぺの可能性も否定できませんけど。。。 2次抗体だけで反応する可能性は否定してますよね。。。まあはんのうするなら、いつでもバンドが出るので気づくでしょうけど。 ペプチド抗体ならいろいろな意味で可能性は少ないでしょうけど、その蛋白のファミリーが引っかかっているとかいうのもあるかもしれません。スプライシングアイソフォームなら抗原部位が完全に一致している可能性はあります。 lysateの調製段階の切断なら、いきなり変性条件で抽出するとかいう選択しもなくはないですし、実験で確認していくことも可能かもしれません。細胞ないですでにプロセッシングが起こっていることもあるので、調整段階の切断が否定できても、全長蛋白の断片である可能性は否定できません。

(無題) 削除/引用 No.3010-2 - 2014/04/30 (水) 13:06:02 - あ 貴方のよそうされるぶんしりょうというのはなにを根拠に出したものですか。

一次抗体と抗原ペプチドインキュベーションで消えるバンド 削除/引用 No.3010-1 - 2014/04/30 (水) 12:21:15 - western western blotにおけるバンドの特異性について質問させて頂きます。 western blot時、一次抗体に実際に反応しているバンドを判断する実験を行っています。(わかりにくくてすみません) 一次抗体を作製している会社から出ている、一次抗体作製に使われた抗原ペプチドを一次抗体と共にプレインキュベートしてから一次抗体反応を行い、プレインキュベート無しのものと比較してノンスぺの判断を行っています。 その際に、目的とする分子量のバンド(薄い)が消えると同時に、目的の分子量よりも小さい分子量のバンド(濃い)も消えてしまいます。 エピトープが似ているノンスぺと想定していたのですが、自身が目的としているバンドが非常に薄く、逆にノンスぺらしきバンドのほうは非常に明瞭に検出されるため、lysateの調製段階でタンパクの切断が起きてしまっているのでは？と考えています。 (lysateの調製方法は論文を参考にしていて、研究室内でこのタンパクのwestern blotを行っている人は他にいません) このノンスぺらしきバンドについて、どのように考えるべきか皆さんの意見をお伺いしたいです。

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