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(無題) 削除/引用 No.3009-11 - 2014/05/11 (日) 10:39:22 - QP mon様 情報ありがとうございます。 UVの当て方次第で結果がちょっと変わりそうですね。 メーカーのを調べて、推奨の方法を実行しないといけませんね。

(無題) 削除/引用 No.3009-10 - 2014/05/09 (金) 23:09:51 - mon >[Re:9] QPさんは書きました : > そのシステムを使ってクローニングまで行った文献をご存知でしょうか？ "sulfo-SBED cloning"で検索すると、例えば、 http://www.jbc.org/content/283/26/17805.full > もし、使用されたことがあるにでしたら、使用感を教えて頂ければとおもうのですが。 ある表面タンパク(A)に対する抗体をラベルして、phage displaying libraryを利用してAに結合するタンパクをスクリーニングしたことはあります。 通常のスクリーニングですと3-4回のpanningが必要ですが、2回で十分でした。 HRP標識二次抗体＋ビオチンチラミンを使用した方がより多くのクローンが得られました（原理的にも納得できます）。 うまく嵌まればスクリーニング効率は良いと思います。 sulfo-SBEDのビオチン転移標識にはUVランプが必要です。私はサザンブロット用のナイロンメンブレンにDNAを結合させるUVクロスリンカーを使用しました。クリーンベンチの紫外線ランプではうまくいかなかった（ビオチン標識されたphageが非常に少なかった）です。ハンディーランプなら上手くいくかも？

(無題) 削除/引用 No.3009-9 - 2014/05/07 (水) 21:55:24 - QP mon様 そのシステムを使ってクローニングまで行った文献をご存知でしょうか？ もし、使用されたことがあるにでしたら、使用感を教えて頂ければとおもうのえですが。 よろしくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.3009-8 - 2014/05/03 (土) 16:14:10 - mon sulfo-SBEDで標識しても結合に問題無いなら、Receptorにビオチンを転移できます。 タグ付きで発現・結合できるなら、抗タグ抗体にHRP標識二次抗体を結合させてビオチンチラミンで周辺のタンパク(100Aほど）をビオチン標識できます。FLAGタグならリジンが含まれているのでsulfoSBEDで標識できます。 あとはストレプトアビジンビーズでpull-downして、タンパク同定かな。

(無題) 削除/引用 No.3009-7 - 2014/05/03 (土) 04:16:10 - protein 最近のnatureに精子IzumoのレセプターとしてJunoを同定したという報告がありました。 中年さんの言うような結合を指標とした発現スクリーニングを行っていましたが、 結合が弱い可能性を考えてリガンドを多量体化させるというような工夫をしていました。

(無題) 削除/引用 No.3009-6 - 2014/04/30 (水) 17:51:40 - 中年 リガンドと受容体の解離定数が大まかにもわかっていますか？結合のみを指標にできるくらい特異的かつ強固なのであれば、アイソトープラベルか機能を損なわないような修飾を加えたリガンドを用いて、結合を指標に発現クローニングするのが一つの方法です。 受容体を発現する標的細胞が比較的扱いやすいもので、さらにリガンド刺激により惹起される応答がモニタしやすいものなのであれば、おおさんの仰るようにshRNAやsiRNAのライブラリーを使った機能クローニングもありです。流行りのCRISPRライブラリーの方が確実かもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3009-5 - 2014/04/30 (水) 12:33:54 - わっち 　ありがとうございます。 pull downとfunctional cloing両方から研究を組み立てていこうかと思います。

(無題) 削除/引用 No.3009-4 - 2014/04/30 (水) 11:39:41 - おお Y2Hはサイトカインのようなもののリセプターにはあまり向かないのですが、、、 キットではいくっついてとれましたとできるくらいならもうすでに報告があるかもしれません。 最近はというとY2Hより新しいはやりということであれば、とにかくpull downしてMSでしょうか。これなら、リガンドが蛋白でなくても対応できます。機能的になにか捕らえやすいout putがあるなら、fucntional cloningでもいいかもしれない。これもより最近の方法論ということであればsiRNAやshRNAライブラリーを使うというてがあります。

(無題) 削除/引用 No.3009-3 - 2014/04/30 (水) 11:34:33 - わっち ご返信ありがとうございます。 リガンドは180アミノ酸のペプチドです。

(無題) 削除/引用 No.3009-2 - 2014/04/30 (水) 11:10:16 - 中年 使える方法論はリガンドの性格に依りますので、どういう種類のリガンドなのかを示していただけませんか？ペプチド？脂溶性低分子？薬剤？

未知レセプターの探索法 削除/引用 No.3009-1 - 2014/04/30 (水) 10:18:13 - わっち 　　お世話になっております。 現在私は、機能未知のリガンドのレセプターの探索を行いたいと考えています。 一昔前は、ツーハイブリッドなどが使われていたと思うのですが、最近はどうなのでしょうか？ もっと、効率のよい方法があるのでしょうか？ 最新のものがあるならば教えて戴きたいです。 自分で知らべた限りでは、プロテインアレイなどがいいのかと思っていたのですが、レセプターに関してはいいキットがありませんでした。 もし、いいキットをご存知の方がいらっしゃれば、そちらの情報も教えて戴きたいです。

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