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(無題) 削除/引用 No.3007-11 - 2014/04/30 (水) 15:10:49 - kk ちょっとだけ質問ですけど、還元剤いれないでSDS-PAGEするときは加熱してますか。 あと、モノマーとダイマーの比率はどのくらいですか。

(無題) 削除/引用 No.3007-10 - 2014/04/30 (水) 14:43:37 - qw 等電点がpH9程度だと思うのですが、ゲルろ過をpH７でやると少しは良いかもしれません。 Hisタグ付きであれば、イミダゾール塩酸を0.1M程度加えることも考えてよいと思います。 それより何より、論文を詳細に探せば、VEGF dimerの精製や、実際にやっていそうな人など出ていそうに思うのですが、どうでしょうか？？

(無題) 削除/引用 No.3007-9 - 2014/04/30 (水) 09:31:16 - おお >ダイマーと思われる位置に溶出しました。 ならばS-S結合なしでもダイマーが維持できるということなので、そう言う結合が弱くなる条件を見つけるのも手かと。なので高塩濃度などの条件をsuggestしました。

ありがとうございます 削除/引用 No.3007-8 - 2014/04/30 (水) 08:08:48 - ダメ男 早速ありがとうございます。 ゲル濾過の溶出位置は、ダイマーと思われる位置に溶出しました。 ヘパリンカラムはご助言頂ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.3007-7 - 2014/04/30 (水) 07:58:49 - おお ヘパリンは強力に荷電しているので、イオン交換的な作用もあるのです。とにかくヘパリン結合ドメイン有る無しに限らず、多種のサイトカインなどがヘパリンカラムをつかって精製されたりしています。またDNAやRNA結合タンパク質なんかもヘパリンカラムを使うことがあります。 小さなカラムが用意できて様子を見ることができるなら分かれるかチェックしてもいいんじゃないですか? >ゲル濾過は Supedex 75pg を使いました。 >バッファーは 20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 0.2M NaCl で行いました。 で分子量的にはどのあたりに出てきましたか?500mMぐらいのNaClやLiClとかだとどうだろう。

ありがとうございます 削除/引用 No.3007-6 - 2014/04/30 (水) 07:07:50 - ダメ男 皆様 ありがとうございます。 おおさま ヘパリン結合ドメインは削っているので ヘパリンカラムは使えないと思います。 ゲル濾過は Supedex 75pg を使いました。 バッファーは 20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 0.2M NaCl で行いました。 私が悪いのですが、途方に暮れております。 ご助言頂ければ幸いです。

(無題) 削除/引用 No.3007-5 - 2014/04/30 (水) 06:30:45 - おお >ヘパリンも使えるかもですね。 ヘパリンカラムのことですよ。ねんのため。

(無題) 削除/引用 No.3007-4 - 2014/04/29 (火) 22:14:55 - qw ＞ゲル濾過ではダメでした。 ゲルろ過は何を使ったのですか？Superdex75/Sephadex G75ですか？溶媒は何を使ったのですか？ 一般論でしか対応できませんが、イオン交換であれゲルろ過であれ、ダメの中味次第だろうなとおもいます。ちょっとやったけどダメなのか、ギリギリまで最適化したけどダメなのか判りません。 ダイマーの方が完全にジスルフィドだけになっていれば、チオールコバレントクロマトグラフィー（ググってちょ）という手段もまあ有るかなと思います。 ところで、VEGFAにタグが付いていたりしないよね？

(無題) 削除/引用 No.3007-3 - 2014/04/29 (火) 21:40:09 - おお ヘパリンも使えるかもですね。ゲル濾過でだめなのは、S-Sの結合なくてもダイマーを形成しているとかいうことでしょうか?ならば塩濃度やpHをいじるともしかしたら分かれるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3007-2 - 2014/04/29 (火) 16:37:13 - mon イオン交換にも陰イオン交換なら、官能基によってQ-,DEAE-、陽イオン交換もありますし、溶媒のpHを変えると、分離パターンは変化します。 ゲル濾過は、分画分子量に対して適正なものを使用しているのですか？ VEGF は小さいタンパクなので、間隙が多いFPLC（低〜中圧用）sepharose系の支持体よりHPLC用の硬い支持体の方が分離が良くなりそうです。 また、異なる分画法としては、疎水性クロマトやハイドロキシアパタイトカラム、場合によってはBlue sepharoseなども使えるかも。

大腸菌可溶性画分でのヒト VEGF タンパク質発現 削除/引用 No.3007-1 - 2014/04/29 (火) 15:36:56 - ダメ男 バカな質問で申し訳ありません。 VEGF-Aタンパク質を Origami2(DE3) 株を宿主として 可溶性画分に VEGF-A タンパク質を発現させました。 VEGF は分子間に SS 結合を有するホモダイマーです。 VEGFダイマーは可溶性画分に発現したのですが それと同時に分子間のSS結合を有しない VEGF 分子も出来てきてしまいました。 還元剤を除いた非還元状態のSDS-PAGEではダイマーのバンドの他に モノマーの位置にバンドが出ます。 還元剤を加えた SDS-PAGE では、すべてのバンドがモノマーの位置にでます。 この分子間の SS 結合を持たない VEGF 分子をカラム操作で取り除きたいのですが、イオン交換、ゲル濾過ではダメでした。 同じような経験をされた方で、有効なアドバイスをいただけないでしょうか。 よろしくお願いいたします。

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