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(無題) 削除/引用 No.2994-12 - 2014/04/24 (木) 18:32:56 - 独り言 Tet-onよりもTet-offのほうが漏れがないと聞いた事あります。

(無題) 削除/引用 No.2994-11 - 2014/04/24 (木) 16:38:08 - (Tet) qw様 ありがとうございます。 製品版とは異なりますが、Flp-in Trexでも漏れが多かったり少なかったあるということですね。tet-onでもサブクローニングすれば漏れのかなり少ない株はとれそうということですね。 試してみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.2994-10 - 2014/04/24 (木) 15:12:32 - qw >使っているTetR発現細胞株が市販品であれば、まあ、それを使って良いのかもしれません。 私はflpin293に自前でTRを入れたので、Flp-In T-Rex 293細胞の使用感はわかりません。 でも、市販品で良いのではないかと思います。 ウェスタンで見た感じで言えば、誘導しない場合、「発現誘導したもの（10secフィルム露光で良い感じ）の1%以上ではない。」と言う感じです。誘導しないと、長時間フィルム露光（10minとか２時間とか）でも発現を確認できません。 例外的に、誘導しなくとも発現のあるクローンが拾えてしまう場合もあります。

(無題) 削除/引用 No.2994-9 - 2014/04/24 (木) 13:24:39 - (Tet) qw様 "使っている細胞のTet repressorの発現が強いことは重要です"。 pcDNA-FRT-TOとFlp-In T-Rexをちゃんと用いてもやはり漏れてしまうのでしょうか？ Flp-In T-Rex 293細胞の中からさらにクローニングが必要ということでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2994-8 - 2014/04/24 (木) 12:52:17 - qw 私の説明（No.2994-3 ）は、pcDNA-FRT-TOとFlp-In T-Rex 293細胞に関するものです。

(無題) 削除/引用 No.2994-7 - 2014/04/24 (木) 11:41:21 - (Tet)< 皆様ありがとうございます。 現在の系ではどうしても漏れてしまうのですね。 lifetecnologiesのpcDNA-FRT-TOとFlp-In T-Rex 293細胞を使っている方はいらっしゃいますか？これならシングルコピーで導入できるので希望がありそうですが。 Tet-offならほとんど漏れないのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2994-6 - 2014/04/24 (木) 08:53:46 - ~ 漏れはありましたね。 ドキシサイクリン無でもrtTA-VP16が発現させてしまうのであれば、rtTA-VP16の発現量が少ない株を取ってくるのが解決法になるかもしれませんが、試していません。 後は、誘導細胞の使用目的次第ですが早めにセルバンクを作り、 継代安定性を見ておけば、その範囲では実験に使えるでしょう。

(無題) 削除/引用 No.2994-5 - 2014/04/24 (木) 04:51:18 - おお 程度がどうにしろいくらかはもれるようです。なので発現量が十分低く影響がない量から誘導するというのができそうなデザインかと思います。目的の遺伝子のプラスみどをトランスふぇくしょんして安定株を作り、ヘルシーに見えるものをクローン化すると、その細胞にあまり影響がない量しかリークしてない細胞が取れるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.2994-4 - 2014/04/23 (水) 23:34:23 - ぺーぺー 実際、論文読んでもtet-offの方がよく使われているので、リークするものなのだと思っていました。

(無題) 削除/引用 No.2994-3 - 2014/04/23 (水) 17:47:24 - qw １）トランスフェクションして一過性発現だと、プラスミドコピー数が多くて、発現が漏れ漏れになる可能性があります。Tet-on DNAの安定発現株をひろう方が確実です。 ２）同時にTet-on GFPのような細胞も作っておくと、評価が楽になります。 もしも、漏れ漏れなTet-onを使っているのであれば、致死的な遺伝子をつないだTet-onでは、安定導入株が得られませんから、ポジコンのようなGFPを用意しておくのは、良いことです。 ３）使っている細胞のTet repressorの発現が強いことは重要です。使っているTetR発現細胞株が市販品であれば、まあ、それを使って良いのかもしれません。自分でTetRを入れるのであれば、TetR安定高発現株をとることが大変重要になります。

(無題) 削除/引用 No.2994-2 - 2014/04/23 (水) 17:29:29 - te 用語が混ざってるように思えるのですが、rtTA-VP16（tet-on）を恒常的に発現しているHEK293細胞に、TREベクターを導入して、doxで発現誘導したいということですよね？ 293細胞ならrtTAやtTAがなくてもTREだけでdoxに関係なく発現はある程度リークします。 rtTA+doxで発現が増強されるので、基底状態の発現が無いように見えるだけです。 基底状態のリークは、何も入っていない293細胞にTREベクターを導入すれば確認できます。 もし、リークを減らしたいのであれば、tTA-KRABなどを併用する方法があります。 完全に防げるわけではないと思いますが、改善はできます。

Tet-on 削除/引用 No.2994-1 - 2014/04/23 (水) 16:42:57 - (Tet)< Tet repressor ありのHEK２９３細胞を、 血清もテトラサイクリン検査済み培地で培養し、Tet-onのベクタートランスフェクションしているのですがテトラサイクリンなしでもそれなりに発現してしました。 細胞に負担がかかるるタンパク質なので少しでも問題です。 Tet-onのシステムってそんなものなのでしょうか。 サブコンフルエントで２日培養しています。１０％血清DMEMでは飢餓気味でTet repressorの発現が落ちてるのでしょうか？何か見落としていそうなことがあればご教授下さい。よろしくお願いいたします。

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