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(無題) 削除/引用 No.2992-13 - 2014/04/23 (水) 11:35:36 - K speed+star様 ＞膵臓を冷凍したら細かい分画には不適だと思う。酵素の多い組織はフレッシュが良い。 ありがとうございます。でもこれ聞いて、自分にがっかりしました。免疫染色でも挑戦してみるつもりです。 皆様、大変ありがたいアドバイスに感謝しております。 しばらく皆様のアドバイスに従って、いくつか再挑戦してみます。 どうもありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.2992-12 - 2014/04/23 (水) 08:02:03 - speed+star 膵臓のランゲルハンス島を取りたいのか腺房細胞をとりたいのか。 核分画をとりたいのかホールで良いのかでプロトコールが変わる気がします。 膵臓を冷凍したら細かい分画には不適だと思う。酵素の多い組織はフレッシュが良い。

(無題) 削除/引用 No.2992-11 - 2014/04/23 (水) 07:20:24 - K 朝起きて、さらに具体的なアドバイスをして頂けたので、感激しております。組織片は液体窒素でまだだいぶ残っているので、先ずは低張液などで試してみようと思います。 さすがは留学ネットの掲示板です。早速今日、皆様のアドバイスに従って、いくつか試してみたいと思います。 どうもありがとうございます。 また報告させてください。

(無題) 削除/引用 No.2992-10 - 2014/04/23 (水) 04:09:39 - おお >[Re:9] みさんは書きました : > ｼｭｰｸﾛｰｽか低張液でホモジナイズして、低速遠心だな。 これに一票。あるいは低張でホモゲナイズ、パーコールで分画たしか40%ぐらいで、核は沈殿してそのほかはほとんど上にくると思う。

(無題) 削除/引用 No.2992-9 - 2014/04/23 (水) 02:20:20 - み 連投すみません よく読んだら核画分をとりたいのか。 RIPAなんか使用したら核も抽出されちゃうよね？ あなたが使用している界面活性剤の種類、濃度が不明だけど、普通は駄目でしょ。 ｼｭｰｸﾛｰｽか低張液でホモジナイズして、低速遠心だな。 膵臓での核分取は経験ないけど、ﾁﾓｰｹﾞﾝ顆粒が邪魔しないかね？

(無題) 削除/引用 No.2992-8 - 2014/04/23 (水) 02:05:35 - み やり取りを見ていてｹﾞﾉﾑなのか脂肪なのか別の問題なのか判断できないけど、膵臓から蛋白抽出していたので一言。 組織重量の8か10倍ボリュームの一般的なRIPAでｿﾆｹｰｼｮﾝすればｹﾞﾉﾑの粘着物は問題にならない。ちなみにｹﾞﾉﾑなら色は透明だろう。液面というより液中にゼリー状の塊としてドロンと存在しがち。 脂肪組織のｺﾝﾀﾐは膵臓を採取するときに注意しないといけない。膵臓と脂肪組織の色は若干異なるよね。 脂肪なら高速遠心しても液面に白い物として浮く。 蛋白分解は消化酵素が多すぎるから避けられないだろうけど、on iceで素早く処理し、蛋白定量してさっさとｻﾝﾌﾟﾙﾊﾞｯﾌｧｰでボイルまで済ませるしかないかな。 凝ったことやろうと思うとｳﾚｱSDSでの抽出などあるな。まあ組織からのウェスタンに慣れている人ならRIPAか1%SDSでじゅうぶん検討できるはずだからあまりファクターを増やさない方が良い。 1%SDSの場合は冷やしすぎるとSDSが析出して鬱陶しいから室温とかでやらないと駄目かなあ。

(無題) 削除/引用 No.2992-7 - 2014/04/23 (水) 00:19:04 - L RIPAだと、低濃度のSDSを含んでいる（もしSDS-freeのRIPAをお使いでしたら、ごめんなさいね）と思うので、ゲノムがネバネバの原因になっていてもおかしくないと思いますが、膵臓という組織の特殊性を考えると、他の原因もあるかもしれないですね。 核蛋白抽出が最終目的の場合は、SDSを含むバッファーでいきなり溶かすより、まず低浸透圧液か、低濃度の非イオン性界面活性剤を含むバッファーで細胞膜を壊してから、核を遠心で回収して、そこからSDSあるいは高塩濃度のバッファーで核蛋白を抽出するのはどうでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2992-6 - 2014/04/22 (火) 23:24:21 - K 連投すみません。 確か以前、p1〜3のラットの心臓からプライマリーカルチャーする際に、心臓をミンチした後にトリプシン処理をしておりましたが、上手くいかない時にはネバネバが多く混在していたのを思い出しました。ゲノムですね、きっと。 戦略を練り直しします。 大変ためになりました。 もし勘違いでしたら、ご指摘頂けると助かります。 どうぞ宜しくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.2992-5 - 2014/04/22 (火) 23:19:48 - K toyoさん ありがとうございます。これまでは心臓とか脳とかからlysateを調製しておりましたが、実は膵臓は初めてです。プロテアーゼ阻害剤は加えておりますが、脳や心臓の時と同程度のプロテアーゼ阻害剤しか入れておりませんでした。プロテアーゼ阻害剤が十分でないと、こういったネバネバが生じるものなのでしょうか？それはやはり、ゲノムが原因ということでしょうか？すみません、膵臓初心者ですので、もう少し詳しく教えて下さると助かります（聞いてばかりで恐縮です・・）。 どうかお願いします。

(無題) 削除/引用 No.2992-4 - 2014/04/22 (火) 22:45:43 - toyo 質問者さんは、他の臓器でlysateを作成した経験があるのでしょうか。 膵臓といえばトリプシンなどのプロテアーゼ生産臓器ですので、 その影響が思い浮かびますが、プロテアーゼ阻害剤は十分に効いていますか?

(無題) 削除/引用 No.2992-3 - 2014/04/22 (火) 22:32:19 - K 実は私も最初はゲノム由来かと思ってたのですが、少し違う感じです。 でもやっぱり先ずはソニケーションしてみます。 それ以外で、膵組織特有の問題点等ご存知の方、いらっしゃったら、どうかお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.2992-2 - 2014/04/22 (火) 22:14:20 - AA ネバネバときくとゲノムじゃないかと思ってしまうのですが、 ソニケーションとかで解決しませんか？ 素人なので見当違いのことを言っているかもしれませんが、予めご容赦下さい。

ラット膵組織からＷＢ用のＬｙｓａｔｅを作れない。 削除/引用 No.2992-1 - 2014/04/22 (火) 21:52:18 - K 誰かご存知の方がいらっしゃいましたら、どうか御教示頂けないでしょうか。 現在、6〜7週齢のラットの膵組織であるタンパク量をウエスタンブロッティングで検出を試みたいと思っているのですが、実はLysate が上手に作れません。膵組織をミンチし、それをRIPAバッファーを用いてダウンスのホモジナイザーでlysateを調製したいのですが、ネバネバしたものが混在してしまい、上手く作れません。このネバネバしている原因が恐らく膵組織にまぎれて混入した脂肪組織がRIPAで溶解され、それがネバネバさせているのではと思っているところです。 実は核画分を700ｘgほどで落としたいのですが、ネバネバひどく、それどころか高速で遠心でも落ちてきません。注射針で切断しようと試みましたが、注射針すら通り抜けできないほどやっかいで、大変困っております。 どなたか、ご存知の方、コツなどを御教示頂けませんでしょうか。 どうぞよろしくお願いいたします。

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