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ご返信ありがとうございます 削除/引用 No.2991-9 - 2014/04/23 (水) 14:14:49 - なつ 皆様 ご返信ありがとうございます。 ＊凍結切片の賦活化の必要性に関して 情報が不足しており申し訳ありません。 目標は40μmの凍結を染めることです。 第一の検討では、40μm凍結切片、（オートクレーブ賦活化あり、賦活化なし）で染色しました。この検討では、オートクレーブ群はすべて落剥し、賦活化なしでは染まりませんでした。 この結果の解釈なんですが、 実験計画の不備でそもそもポジコンの設定ができておらず「抗原があるのか」「染色過程が適切だったか」すらわからない状態だったのですが、、、（一応先行研究では同種のマウス、同週齢のパラフィンで染まってます） 「賦活化が必要（そうだ）」（オートクレーブ群が全滅だったので断言できない） 「切片の厚みの問題で染まらない（かも）」 と不備だらけの結果になってしまい。とりあえず「厚みのない切片で」「賦活化ありで」という条件で検討を行いなさい。ということになり、現在に至っています。 皆さんのおっしゃられるようにもっと勉強してなぜ必要なのかを考えなければならないと今更後悔しています。ご指摘ありがとうございます。 ＊オートクレーブ以外の加熱賦活化に関して どうせ凍結剥がれちゃうからやらなくていいよ。と言われたのと、HE染色の時も40μm凍結切片ですと1/5程剥がれてしまうので、私も無理かなと思ってしまい検討もしていませんでした。 今回の結果もふまえてまずは、先生とご相談し、賦活化なしの実験を組んでみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.2991-7 - 2014/04/23 (水) 11:23:16 - alpha 以下でも指摘されていますが、凍結切片の賦活化は基本的に必要ないと思います。 4% PFAの固定なら十分だと思います。 実際に、賦活化せずに染色すると染まらないのでしょうか？ 3umはちょっと薄すぎるように感じます。 私は5umで作成していますが、ラボでは7umで作成している人もいます。

(無題) 削除/引用 No.2991-6 - 2014/04/23 (水) 08:53:19 - 組織 賦活化（retrieval）というのは、パラフィンブロック作製時の抗原性低下（有機溶媒や加熱による）を補うための手法であって、抗原が良く保持されている凍結切片では基本的に不要です。皮膚は切りにくく、剥がれやすい臓器なので、私ならまず不活化せずに染めます。 先生もあまり詳しくなさそうな感じなので、自分でも成書で勉強することを勧めます。

(無題) 削除/引用 No.2991-5 - 2014/04/23 (水) 08:13:53 - speed+star 上司の顔を立てるならば、上司の言う条件も含めて条件を振るのが良い。 プロケー処理はinsituなどで透過性を上げるため行う場合があるが必要ない場合が多い。オートクレーブやクエンサンバッファーでの加熱は過固定を脱架橋してるというのが理屈だと思います。有機溶媒やピクリン酸での固定はタンパク変性や脱脂。固定方法の原理を理解して、エピトープとの関係を考慮して実験計画を練りましょう。

(無題) 削除/引用 No.2991-4 - 2014/04/22 (火) 23:30:25 - L 凍結切片の場合、抗原賦活化は必ずしも必要ないのですが、PFAの固定時間によっては、やった方がいいのでしょうか？　他の有機溶媒で固定して、抗原賦活化のステップを省略するのも手かもしれません。 加熱による賦活化は、オートクレーブを試されたようですが、他の方法はどうでしょうか？　パラフィン包埋組織の切片の場合は、クエン酸バッファー（pH 6)やTrisEDTAバッファー（pH8-9）で、電子レンジや煮沸で加熱する方法でも結構うまく行きます。私のラボでは、凍結切片の場合、基本的に抗原賦活化をやっていないので、なつさんの凍結切片サンプルでうまく行くかは、やってみないと分かりませんが。

ご返信ありがとうございます。 削除/引用 No.2991-3 - 2014/04/22 (火) 23:17:36 - なつ AA様 ご指摘ありがとうございます。 先生によると、パラフィンで染めた時には賦活なしだと染まりにくかったらしく、賦活化はしなければ…とのことでした。 賦活化後の組織の状態ですが、今回のProKの濃度ですと、つるつるとまではいきませんでしたが、ほとんど組織は残らない感じでした。 一度先生とご相談し、耐久性の問題の検討として賦活化なしで染めてみようと思います。 賦活化のアドバイスまで頂いてありがとうございます。 その件も含めて検討していきます！

(無題) 削除/引用 No.2991-2 - 2014/04/22 (火) 22:20:51 - AA 3umは結構薄いと思いますので、賦活に耐える可動化不安であります。 特にProKやトリプシンではガラスがつるつるな感じまで組織が落ちたのではないでしょうか？ 指導教官の指示ということで逆らいづらいとは思いますが、 試しに賦活化なしで染色してみてはいかがですか？ 質問者さんが挙げられている問題点のうち、 乾燥不足と貼付けの問題は、賦活化に関係なく切片の剥落が起きると思います。 賦活化のみで問題が起きるのであればやはり賦活化ステップ自体に問題がありそうです。 どうしても賦活化をしたいのであれば、 80〜90℃ほどにしたpH6.0のNa-Citrate buffer中に10〜30分程度おいて見るのはいかがでしょうか。

凍結切片　ProKでの抗原賦活化 削除/引用 No.2991-1 - 2014/04/22 (火) 20:17:55 - なつ 現在免疫染色のための抗原賦活化条件検討を行っております。 指導の先生からの助言で賦活化は行ったほうがいいとのことで条件検討をしています。 凍結切片 サンプル：マウス皮膚 固定：4％PFA 厚さ：3μm 乾燥：ドライヤー（30分）→冷凍庫（2ｈ） スライド：APSコート付 今までの検討： オートクレーブ（120度15分）ではほとんど剥がれてしまいました。 ProteinaseK（0.4mg/ml／0.05 mol/L Tris-HCl、pH 7.5.（37度, 5分・10分・15分））orトリプシン（1%トリプシン/PBS（37度, 5分・10分・15分））の条件では、すべての条件の組織がばらばらになってしまいました。ややProKのほうがダメージが少なかったように感じました。 今回の検討：ProKの濃度が高かったことを考慮し、今回は、ProteinaseK（20μg/ml／0.05 mol/L Tris-HCl、pH 7.5.（37度, 5分・10分・15分））でチャレンジしたところ5分の条件でも組織の剥がれと崩れがででしまいました。 今考えている問題点： 薄切手技の問題→重なり等がありスライドに密着していない サンプルの問題→固定がうまくいっていない。体感的にいつもよりやや組織が柔らかい気がしました（しかし先生が固定したサンプルをお借りしているので固定に不備があったとは思いにくい） 乾燥の問題→乾燥が甘い 以上の問題点以外に考えられる問題はありますでしょうか。 なかなか条件検討すら進まず悩んでいます… アドバイス等もございましたら何卒宜しくお願い致します。

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