全28件 ( 1 〜 20 )　 前 | 次 　1/ 1. 2. /2

(無題) 削除/引用 No.2991-29 - 2014/05/15 (木) 09:40:57 - AA 確かに抗体染色の場合、非特異反応なのにそれらしいシグナルパターン、 ということもおうおうとしてあるので要注意です。 ポジコン(発現が強い組織、強制発現細胞等)とネガコン(欠損動物の組織など)を しっかり設定することが実験をする上で重要です。 さて、ところで賦活化ですが、 パラフィンの場合はオートクレーブだったのですね。 であるならやはりオートクレーブないし他の加熱法での 賦活化を試してみることをおすすめします。

(無題) 削除/引用 No.2991-28 - 2014/05/14 (水) 17:08:07 - 組織 追試が必要がどうかは、その実験でどのくらいの精度のデータが必要かということなので、私には分かりません。ただ、抗体の特異性は慎重に判断すべきだと思います。一番簡単なのは、その抗原が確実に発現している臓器を染めることでしょうね。

ご返信ありがとうございます 削除/引用 No.2991-27 - 2014/05/14 (水) 15:39:33 - なつ 組織様 ご返信ありがとうございます。 購入元で特異性試験済みであっても特異性に関して追試験をする必要があるのでしょうか。であれば、特異性に関する実験も追加しなければならなそうです；； 「パラフィンと凍結の染色条件　異なる点」 ・プロトコル パラフィンではABCMethod使用 ・賦活化 パラフィンではオートクレーブ 凍結ではProK ・二次抗体 凍結ではFITC標識抗体 なので、賦活化がやはり問題かと思っていたのですが1次抗体の問題となるとそもそもが怪しくなってきますね

(無題) 削除/引用 No.2991-26 - 2014/05/14 (水) 13:48:25 - 組織 >[Re:25] なつさんは書きました : > 抗体の活性 > 1次抗体は同時に染めたパラフィンが染色されているので大丈夫かと…ただ二次抗体は蛍光を用いたので、こちらが劣化している可能性もあります。 これは特異性の証明にはなりません。証明するには、適切な陽性対照を染めるか、抗原吸収試験をするなどの実験が必要です．ざっくり言うと、出来の悪い抗体は結構多いので、染まったからといって特異的がどうかは別問題です。あとパラフィンよりも、凍結切片の方が抗原が圧倒的に良く保持されているので、パラフィンと結果が食い違っている場合はまず凍結切片を信用するのが一般的です。

ご指摘ありがとうございます 削除/引用 No.2991-25 - 2014/05/14 (水) 12:01:19 - なつ ご返信ありがとうございます。 40μである必要性 40μでないと観察しにくい部分で、論文投稿する際もその画像の方がかっこいいよとのことで40μで行っています。連続切片で観察していけば最終は問題ないです。 40μでの検討 かなり期限的に切迫してきているので、40μで条件検討させてもらえるよう相談します。その際に浮遊法の検討も聞いてみます！（ただ研究室でやった人を知らないです。少なくとも学生は全員したことなかったみたいです） ProK処理での抗原性の保持 抗体を購入している企業のHPでは、ヒト培養細胞の蛍光標識でProK処理を行っている様子でした。 抗体の活性 1次抗体は同時に染めたパラフィンが染色されているので大丈夫かと…ただ二次抗体は蛍光を用いたので、こちらが劣化している可能性もあります。

(無題) 削除/引用 No.2991-24 - 2014/05/14 (水) 07:31:08 - 組織 そもそも抗体は本当にワークしてるのでしょうか？ 前に染まったということですが、特異性を示す根拠はありますか？ 実験の進め方については先生の意見に従えばいいと思いますが、個人的には40 umの浮遊切片の方が話が早いと思います。

(無題) 削除/引用 No.2991-23 - 2014/05/13 (火) 20:12:51 - よっしー 下のほうで未固定も提案されていましたね． 飛ばして読んでいました． 失礼しました．

(無題) 削除/引用 No.2991-22 - 2014/05/13 (火) 19:57:13 - よっしー あくまで”私の場合は”ですが，どんな組織でも凍結切片を作る場合は前固定はしません．温度を調整すれば大抵の組織で綺麗に切片が切れます．切片が切れれば，乾燥させた後凍結などはせず，切片をアセトン，4%PFA，メタノールなどで固定し，染色します．賦活化は行いません．これらの条件でどうしても染色できない時に限り，賦活化の条件を探ります． 私はいつも5−6μmで切っていますので，40μmではどうだか分りませんし，抗原の局在，抗原量，抗体にも依存するとは思いますので，一概には言えませんが・・・

(無題) 削除/引用 No.2991-21 - 2014/05/13 (火) 15:28:00 - AA 剥離がなくなったということでまずはおめでとうございます。 おそらく乾燥不足だったのでしょう。(15分のは消化されたのだと思います) 条件検討については指導の先生のいうことに従うのが一番ですが、 個人的にはやはり40でやるほうがいいような気がします。 3umできちんと染まる条件が見つかったとして、 40umで試して染まらなければ40umで染まる条件を新たに確立する必要があり、 その場合は3umで条件を確立するのにかけた労力は無駄になってしまいます。 （もちろん学生の経験としては十分に意味があるものだとは思いますが） 3umでうまくいくなら3umのデータで十分な気もしますが。。。 光る光らない、という表現をされているので蛍光染色だと予測しますが、 共焦点で見ているのであれば薄い切片でも問題無いですが、 一般的な蛍光顕微鏡ですと40umの厚みの切片は単純に3umの10倍以上の細胞数があるわけですので、 40umでシグナルが見られて3umでは見られないということもありうるかと思います。 ちなみに、Proteinase-Kの分解で抗原性はきちんと維持されるのでしょうか？ ProKのせいで抗体が反応しないというケースもあるかと思います。

厚みに関して 削除/引用 No.2991-20 - 2014/05/13 (火) 12:47:01 - なつ 先に40μの条件ですべきとのことなのですが、 先生とお話ししたところ、 「40μでやってみるとするよ。もしここで40μで染まりませんでしたとなる。じゃあそれは何が問題だったの？賦活化の方法もあるよね。厚みの問題もあるかもしれない。厚みのせいで抗体の浸透が悪いのかもしれない。わからないでしょう。先に40μでして本質の問題がわかりますか？」 とのこと。ごもっともだと納得したのですが…違うのでしょうか…

ご返信が遅くなり申し訳ございません 削除/引用 No.2991-19 - 2014/05/13 (火) 12:39:48 - なつ 皆様 ご返信が遅くなり大変申し訳ございません。 先生と話し以下で再挑戦いたしました 凍結切片 サンプル：マウス皮膚（固定が不安だったので今回は自分のサンプルでさせて頂きました） 固定：4％PFA 厚さ：3μm 乾燥：ドライヤー（3ｈ） スライド：APSコート付 （AA様：期限も確認いたしました有難うございます） （L様：混乱させてしまい申し訳ありません固定→凍結→染色の順です。） 賦活化なし群、ProteinaseK（20μg/ml／0.05 mol/L Tris-HCl、pH 7.5.（37度, 5分・10分・15分））でチャレンジしました。 結果：15分は剥がれてしまいましたが、そのほかは組織の剥離はほぼなし！ここで歓喜して染色を進めていきましたが、、、すべて光りませんでした… 解釈：剥離自体はサンプルの問題があったようですが、光るはずのものが光っていないのでやはり賦活化が不十分だったようです。 浮遊法は当研究室では行ったかたがいらっしゃらなかったのでなかなか提案できませんでしたが、一度提案してみます。 私自身は医学系で病理教室に機器を借りに行ったりしているのでその時に少し相談してみます！ この結果先生にお伝えしたのですが、剥離なしの結果を伝えたときは二人で歓喜していたのですが、結局染まらなかったので、どうしたらよいものかわからなくなってきました。

(無題) 削除/引用 No.2991-18 - 2014/04/26 (土) 15:49:40 - 名無し APSコートなので、一応剥離防止処理はされているスライドグラスとおもうんだが、最近はいくつかのメーカー（また同一メーカーでも新規に）でいろいろな方法で剥離防止処理したスライドグラス出してるから、代理店の人に相談していくつかサンプル品もらって比較検討したらどうよ。自分自身の標本は剥がれる事はないので分からないけど、スライドグラスによって切片の広がり方とかは結構違うよ。 乾燥や固定もある程度かんけいあるかもしれないけど、結構適当にやっても剥がれない組織は剥がれないので、一番大きいのは組織の特殊性かもしれない。なので、もし医学か獣医学なら皮膚科で病理やってる人に聞くといい。あるいはdermatology関連の雑誌で日本の研究機関から出てる論文さがして、メールで聞けば教えてくれるとおもう。

(無題) 削除/引用 No.2991-17 - 2014/04/25 (金) 20:26:17 - AA 40umの切片での染色を目指して3umで条件検討するのは無意味です。 目指す厚みで切りましょう。 おそらく先生はパラフィンしか使ったことがないのだと思いますが、 パラフィン化したサンプルと凍結サンプルは抗原の保存性が全く異なるので 同列に語ることはできません。 既に指摘されている通りですが、賦活化なしでの染色は手技的には省略するステップがあるだけなので、 平行してやってしまいましょう。 もちろん、固定次第では過固定などによる抗原のマスキングなどあります。 剥がれることについてですが、以前、使用期限の切れたMASコートグラスを使用したら 全く張り付かなくなったことがありました。 スライドグラスの使用期限にはご注意下さい。

(無題) 削除/引用 No.2991-16 - 2014/04/23 (水) 23:47:59 - L なつさんの先生のご意見と、自分の考えが噛み合ないように思っていたのですが、Fさんのコメントを見て、勘違いに気がつきました。まずPFAで固定してから凍結して切片を作ったという事ですね。その場合は抗原賦活化が必要と思うので、先生の指示に従った方が良いですね。新鮮凍結サンプルからまず切片を切って、その切片をPFAで固定したものと勘違いしてました。どうしても駄目なら、先生のサンプル作成の過程で、固定法を変えたり、未固定で凍結切片を作ったり、工夫して下さるような気がします。

(無題) 削除/引用 No.2991-15 - 2014/04/23 (水) 18:51:18 - F パラフィンで染まるなら凍結を試さなくても、と思うのですが。 何かあるのでしょうね。 私も切片の剥離で苦しんだので参考になれば。 クエン酸やEDTAの加温はオートクレーブや沸騰させるほど高温でなくても有効でした。 今の私だったら固定液を変えるか未固定で切るかかなぁ。 >先生によると、パラフィンで染めた時には賦活なしだと染まりにくかったらしく、賦活化はしなければ…とのことでした。

(無題) 削除/引用 No.2991-14 - 2014/04/23 (水) 17:19:08 - 組織 40 umの切片を貼付け法でオートクレーブしたら、剥がれるのは当たり前だと思います。30 um以上は浮遊法で染めた方がいいです。 最終目的が40 umなら、わざわざ薄い切片で予備検討するより、40 umの浮遊切片を使って実験した方が効率的だと思います。そうすれば固定とか乾燥は気にしないていいし、次のステップに進めるんじゃないですか。

(無題) 削除/引用 No.2991-13 - 2014/04/23 (水) 16:53:50 - speed star 賦活化なしも貴重なサンプルでなければ手間もいっしょだからやるべき。 頑張るのでやらしてください！とアピールしましょう。 還流の有無や浸漬固定の時間、細切しているかなどで固定の強度は変わります。 凍結切片は強めに固定しがちなので抗原が固定に影響されるのであれば賦活化は必要なことが多いです。その抗体の性質を理解するのも大切です。 あと、弱い界面活性剤で処理すると剥がれずに透過性が上がり染まり易くなることもあります。

(無題) 削除/引用 No.2991-12 - 2014/04/23 (水) 16:41:00 - なつ speed+star様 ご返信ありがとうございます。 梯子に立てて、上から固定したドライヤーで30分しているのですが、、、うまくあたっていないのかもしれません。 次回は、しっかりあたってるか確認してみます。

先生と話してきました 削除/引用 No.2991-11 - 2014/04/23 (水) 16:35:52 - なつ 先ほど先生とご相談してきました。 薄切の問題と乾燥の問題もないとは言い切れないが、固定の問題は大きいかもしれないねとのことでサンプルを変えて同じプロトコルで染色してみることになりました。 賦活化なしも提案したのですが、それはでないから無駄です。とのこと、、、 先輩からやっちゃったらいいのにと言われながらも悩んでいます。自分の実験なので、そのようにプロトコルを組みたいと思いつつもまだまだ未熟なので従うべきかなとも思っています。

(無題) 削除/引用 No.2991-10 - 2014/04/23 (水) 16:25:15 - speed+star 剥がれるとのことですが、しっかりと乾燥させれば、（ドライヤーの冷風でしばらく）加熱賦活化程度でははがれませんよ。APSコートがダメになっているのかな？そんな経験がないのでわかりませんが。中心から剥がれるようであれば固定不足です。

全28件 ( 1 〜 20 )　 前 | 次 　1/ 1. 2. /2

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---