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(無題) 削除/引用 No.2990-5 - 2014/04/24 (木) 14:57:15 - かっぱ はなはなさま ご返答ありがとうございます。 非特異バンドが見えるのであればコントロールの取り方が難しくなります。抗体は精製していますか？ノックアウト変異体があれば良いのですが。 抗体は生成したものを使用しています。ノックアウト変異体は探してみたのですが有りませんでした。 差し支えなければ植物種は何か、ホルムアルデヒド処理の際に気をつけていることなどをお伺いしてもよろしいでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2990-4 - 2014/04/24 (木) 00:57:13 - はなはな 違う植物種でChIP-seqやってます。ただしGFPやヒストンをIPしているのでちょっと違うかもしれません。 >・核の分離を行うべきか？行うならば分離できたかの確認する手段が有るのか？ した方が良いと思います。顕微鏡で確認できます。 >・磁気ビーズとカラム抽出どちらが良いのか？ ビーズしか使ったことが無いのですがうまくいっています。 >イネをすり潰した液に対してウエスタンを行ってもバンドが見られたので、ChIPの系がうまくいけば何かしらの結果は出るものだと思っております。 非特異バンドが見えるのであればコントロールの取り方が難しくなります。抗体は精製していますか？ノックアウト変異体があれば良いのですが。

(無題) 削除/引用 No.2990-3 - 2014/04/23 (水) 20:32:30 - かっぱ seven様 ご返答ありがとうございます。 ・抗体のターゲットは内在のタンパクですか？外来の融合タンパクですか？ 　抗体のターゲットとしているタンパク質は内在のものです。 ・内在のものの場合、その抗体での実績はありますか？ 　ペプチド合成で作成した抗体です。ウエスタンブロッティングで確認したところ組換え大腸菌をつかって精製した目的タンパク質に対して結合していました。イネをすり潰した液に対してウエスタンを行ってもバンドが見られたので、ChIPの系がうまくいけば何かしらの結果は出るものだと思っております。 ・CHIP後のDNA定量などは行っていますか？ 　ChIP後のDNA定量はリアルタイムPCRでしか行っていません。次の実験でバイオアナライザーを試してみようと思います、ありがとうございます！ChIP法の系から免疫沈降のステップのみを省いて得られたInput DNAに対してバイオアナライザーをかけました（断片長の確認のため）がその際はDNAが検出できたのでおそらく・ホルムアルデヒドによるクロマチン構造の固定・免疫沈降のステップのいずれかに問題があるのではないかと考えています。

(無題) 削除/引用 No.2990-2 - 2014/04/23 (水) 15:49:56 - seven CHIPは専門ではないですが 抗体のターゲットは内在のタンパクですか？外来の融合タンパクですか？ 内在のものの場合、その抗体での実績はありますか？ 融合タンパクの場合、融合タンパクが機能していることを突然変異体の表現型レスキューなどで確認できていますか？ CHIP後のDNA定量などは行っていますか？ バイオアナライザーなどを使えば、微量のDNAでも存在は確認できます。

植物体（イネ）を用いたクロマチン免疫沈降法 削除/引用 No.2990-1 - 2014/04/22 (火) 11:00:00 - かっぱ いつも勉強させていただいています。初投稿で至らない点も有るとは思いますがよろしくお願いいたします。 現在、イネを用いてある転写因子の標的遺伝子を同定したくChIP-seqの前段階としてChIP-qPCR実験を重ねているのですが、うまくいきません。 具体的な問題としては最後のqPCR時点でDNAが検出できないか35サイクル以降でしかDNAが検出できません。 KitはEpiQuik Plant ChIP Kitを用いておりプロトコルもこれに準じて行っております。 qPCRに関しては特に問題ないと思われますのでChIPの行程に問題が有ると考えられます。 質問したいのは ・イネに限らず植物体を用いたChIPについておすすめのKit、プロトコルは有るか？ ・核の分離を行うべきか？行うならば分離できたかの確認する手段が有るのか？ ・磁気ビーズとカラム抽出どちらが良いのか？ ・ホルムアルデヒド濃度を１％以外でやってる方はいらっしゃるか？ 他にも気をつけるべき点が有れば教えていただけるとありがたいです。 よろしくお願いいたします。

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