BioTechnicalフォーラム [極々々々初歩的な質問ですが…]

極々々々初歩的な質問ですが…

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No.2988-TOPIC - 2014/04/21 (月) 20:01:29 - a

初心者です。
STAT3の直接のターゲットがある転写因子であることを確認したいのですが，どのような実験系を組めばいいのでしょうか？

初歩的すぎてすいませんがご指導お願いします。
　

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No.2988-8 - 2014/04/21 (月) 23:58:38 - おお

実験的にとかいてましたね。すいません。。。
もし候補の遺伝子があるなら、promoter enhancer領域にstatのコンセンサス配列を見つけること。
ここから幾通りかの方法があります。

一つはChipによりコンセンサス配列を含む領域に結合していることを確かめる。これは実験的に難しい部分もあるので、ネガにでても完全なひていはできない。

もう一つはpromoter enhancer領域をレポータープラスみどにクローにんぐする。STAT3でそのレポーターが動くことを確認し、trancationやstat3コンセンサス配列に変異をいれたりして、実際にそのコンセンサス配列が発現制御にかかわっているかみる。最終的にはそのコンセンサス配列を含む領域でEMSAなどのassayをして直接的結合を見ることになるかと思います。EMSAであればどんな場合も直接的といえるかというとそうでもないのでそれはそれぞれの実験事情や状況によって、実験を工夫するか、どこまでやればよしとするかは判断してください。

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No.2988-7 - 2014/04/21 (月) 23:39:08 - L

「直接の」というのがポイントですね。単にその転写因子のプロモーター領域をクローニングしてレポーターにつなぎ、例えばSTAT3 KOの細胞に、恒常活性型のSTAT3と一緒にそのレポーターを入れても、「直接の」ターゲットであるとの証明にはならないという事ですよね。

この場合、まずはプロモーター領域にSTAT3結合配列があるかどうかをデータベースで調べ、そこに活性化したSTAT3が結合するかどうかを実験的に見るのが第一と思いますが、結合していた場合に、それが転写活性を実際に持っていて、直接（基本転写因子どうこうというのは「直接」の定義からはずすとして）そのターゲット因子の転写をつかさどっているかどうかを調べる方法については、この手の実験に精通した方の御意見を伺った方が良さそうです。（私には責任もってお答えできる力がありません。ごめんなさいね。）In vitroの実験系とか、あるのかな？

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No.2988-6 - 2014/04/21 (月) 23:12:27 - TS

転写因子の候補があって、それがstat3によって転写制御されるか、ということ？
それともなんでもいいから、stat3で制御される転写因子を見つけたいということ？

(無題)

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No.2988-5 - 2014/04/21 (月) 22:45:54 - a

ありがとうございます。

実験的に調べたいと思っております。

データベース上から調べるwebサイトもあるのでしょうか？

(無題)

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No.2988-4 - 2014/04/21 (月) 22:40:58 - おお

実験的にしらべるという事でしょうか、それともデーターベースとか既知のものから調べるということでしょうか