２の言うように、具体的な状況よくが分からないのでいくつかのケースに分けて書くから、該当するのがあれば、参考にして。もし該当なしなら、もっと偉い人がレスつけるまで待って。
もしも膜全体に渡ってスメアというか縦方向の雨上のノイズならば、原因はゲル溶液の汚れと思うので、ゲル溶液を一新するかフィルター通せば消える。
サンプルを流したレーンでスメアになるなら、２つの場合がある。一つは条件の不適切さで起こるアーティファクト。たとえばアプライした蛋白質量が大杉でかつ抗体が今ひとつのような残念な組み合わせの時に起こりやすい。抗体を精製濃縮すればある程度改善するけど、ぶっちゃけそんな手間かけるよりも買い直した方がいい。抗体が変性しかかってたり駄目になってきてるときも、スティッキーになっていろんな蛋白質にべたべたつきやすくなってそうなることある。抗体原液に変な濁りや沈殿があればその可能性big. この場合は蛋白質のパタンに近い画像になったりする。還元処理が不完全で分子間S-Sが切れなかったり、いちどきれたS-Sが再酸化された時にもスメアになる。思い当たるならば新しい還元剤を使い、濃度や加熱時間を変えてみるなど試みてほしい。SDSによる変性処理が不完全だったり（SDSに対して蛋白質濃度があまりに高過ぎなど）
、非常に疎水性の強い膜貫通蛋白質などのようにSDS変性に抵抗性のあるものも複合体が完全に解体せずスメアになることがある。SDS濃度をあげたり、熱処理せずに長時間室温〜４０CくらいでSDSに晒すなどの工夫であるていど改善する。
さてもう一つは科学的に意味がある場合なんだが、たとえば、3が指摘しているように、蛋白質の分解で、この場合エピトープを含むペプチド断片は全部反応するんだが、ランダムあるいはエキソで橋から順にトリミングされてるとそれらのシグナルがかさなって連続的なスメア画像になる。この場合、基本的には本来の分子量から下にシグナルが出るので察しがつく。逆に本来の分子量から上にスメアになるなら一つはコバレントな蛋白質修飾が考えられる。ユビキチンとか、その仲間のちっちゃい蛋白質が鎖状にくっついたりしてるとき。長さの異なる多数の糖鎖をもつような糖蛋白質も考えられる。もありうる。何らかの原因で蛋白質が自身あるいは他の蛋白質と分子間でランダムな架橋を形成した場合もそうなることある。 |
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