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(無題) 削除/引用 No.2973-7 - 2014/04/16 (水) 22:46:17 - mei なさん、ちょーさん、そして〜さん、 ご指摘ありがとうございます。 不思議なことはCHOにTransientで発現させると、ちゃんとした抗体ができます（ELISAで抗原結合能をみると）。 ですので、選択中になにかが起こっていると思われます。 培地は確かに違います（293；DMEM、CHO;RPMI）。 まずはLCを認識する抗体を購入して、WBで確認してみます。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.2973-6 - 2014/04/16 (水) 08:59:45 - ~ 培地は293とCHOで同じものを使っているのでしょうか？ CHO用の培地にのみKolliphor P188が入っていて、 それがELISAによる検出を阻害したりしていませんかね。

(無題) 削除/引用 No.2973-5 - 2014/04/16 (水) 07:52:21 - ちょー CHO細胞は抗体の産生にもよく使われるので、抗体産生に不利という事はないと思います。 気になる点は抗原が何かということで、293細胞は産生しないけど、CHO細胞が産生している（ファミリータンパク質を含めて）可能性はないでしょうか。まったく関係ない抗原であれば無視して下さい。 抗体が正しくできているかを見るために、非還元状態でSDS-PAGEかWBをして、293細胞で産生されたものとほぼ同じ位置にあるかを確認する方法も考えられます。

(無題) 削除/引用 No.2973-4 - 2014/04/16 (水) 07:39:28 - な 293とCHOの間のシャペロンなどの違いが関係している、という仮説を考えました。

(無題) 削除/引用 No.2973-3 - 2014/04/15 (火) 23:40:40 - mei おおさん、 いろいろと可能性のご指摘ありがとうございます。 少し説明不足のところがありました。 すべての実験では培養のSupを使っています。 そのため、CHOで発現させた抗体がERにとどまっていることは無いかと思っています。 またGenotypingはしていまして、LCおよびHCのIntegrationは見ていますが、RT-PCRはしていません。 ただ、同じベクター上に乗っているものが一方が発現して一方が発現しないこともなかなか考えにくいです　（CHOでのTransientでは抗体の生産が確認されているため、プロモーターはいいはずです）。 おおさんがご指摘されましたようにLCの抗体を使ってみるのが手っ取り早いと思っていますが、それでLCが確認できなかったとき、あるいは確認できてもたしかになかなかその解決法が見つからないです。

(無題) 削除/引用 No.2973-2 - 2014/04/15 (火) 22:43:14 - おお WBを細胞のLysatesでやっているなら分泌してない可能性。膜蛋白はERで合成されてソートされるものがおおいが、そのシステムが強発現のため飽和して機能しなくなる場合が結構あるらしい。 上澄みをWBしているならfoldingがうまくいっていない可能性。 LC蛋白が確かにうまく発現してない可能性はありますが、それは検出用の抗体を変えればわかるでしょう。 上記の問題の時どんな解決方法があるかというと、ドラスティックな改善が望めるかどうか微妙です。

抗体産生細胞のセレクション後に起きた不思議な問題 削除/引用 No.2973-1 - 2014/04/15 (火) 22:09:06 - mei 皆さんの知識と経験をお借りできればとおもい、投稿させていただいています。 抗体産生細胞（CHO)を作りました。 これは目的の抗体を豊富に産出するためです。 プラスミドはHCおよびLCが同時に発現するDualを作って（Single vector)、Zeocin選択で選択しました。 まず293細胞のようなものにこのプラスミドを入れると、抗体が産生されます。 これはそのIgGに対する抗体によるWesternおよび産生された抗体のEpitopeを用いたELISAの両方で確認済みです。 そして、CHOに入れてZeocinで選択したところ、明らかにコロニーが出現しました。 これはTransfectionしない際にはそのCHOは全滅したことより、間違いなく選択がかかっていると思われます。 コロニーをいくつかピックアップして、常にZeocin存在下で培養しました。 まず、抗体産生をWestern blotで確認すると、293でTransientで発現したときにくらべて若干いいぐらいの抗体発現が確認されました。 ところが、同じサンプルをELISAで確認しようとしてもまったく確認できないです。 293で発現させたサンプルは値が振り切れるぐらいDetectできているにもかかわらず、CHOではまったく確認できないです。 ZeocinはDNAのインターカレート剤みたいですので、抗体の構造に影響を及ぼすとも思えないのですが、念のため、293のサンプルにZeocinを高濃度で入れてみても、もちろんその抗体はELISAでばっちりと確認できます。 非常に不思議で、何か見落としがあるのかと思い、この一連の作業を3回繰り返しましたが、まったく同じ結果になってしまいました。 Westernのときに使った抗体はFcを認識するものですので、HCのみが発現し、LCが発現しないならば、この現象は起きうるかもしれません。 もし何かアドバイス等がありましたらぜひ教えてください。 よろしくお願いいたします。

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