BioTechnicalフォーラム [floxedマウス(fl/fl)とより欠損効率が高い(fl/-)について]

floxedマウス(fl/fl)とより欠損効率が高い(fl/-)について

No.2971-TOPIC - 2014/04/15 (火) 10:45:37 - 浅学者

大学院に今年度入ったばかりの浅学者です。

floxマウスを使って、神経細胞におけるあるタンパク質の機能を研究している論文を読んでいます。
floxedマウスのrecombinant genomeは理解できましたが、この論文の中ではより欠損効率の高いfl/-マウスも更に使っています。

私の理解が正しければ、fl/flマウスはNestin-Creによるrecombinationが100%ではない時に、fl/-マウスを代わりに用いてよりノックアウト効率を高めようとしているのだと思います。

大変稚拙な質問で恐縮ですが、fl/-マウスを得るためには+/-マウスが必要だと思うのですが、このマウスはどのようにして作製するのでしょうか？

germ cell specificなCreとfloxedマウスを掛け合わせて産まれたマウスという理解でしょうか？
どうか教えてください。よろしくお願いします。
　

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No.2971-13 - 2014/04/18 (金) 17:34:43 - L

CAGCreがホモの可能性があるならば、厳しいですね。CAGCreも一回野生型とかけて生まれてきたマウスのCAGCreを見ておく必要がありますね。結局先にCAGCreが入ってない+/-が得られるまで野生型とかけた方が、早いかもしれない。

(無題)

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No.2971-12 - 2014/04/18 (金) 14:36:36 - AA

Lさんの指摘のとおりですが、あえて付け加えるのであれば、、、

一般的に狭義の意味でのTgマウスの場合、
挿入されている遺伝子座がわからない場合がほとんどだと思います。
したがってプロモーター末端部からCre配列起始部にかけての
PCRで遺伝子型を判定することになりますが、
この場合、Nestin-CreとCAG-Creの区別はついても
それぞれがホモ接合なのかヘテロ接合なのかを区別することができません。

f/+;CAG-Cre+マウスがCreのホモ接合だった場合、
どんなに交配しても生まれてくる子供はCAG-Cre+です。
f/+;CAG-Creマウス作出の交配に気を使えば避けられますが、
そこに気を使うくらいなのであれば一度野生型と交配して
+/-の系統を作るほうがスマートな気がします。

指摘いただいている通り、Cre同士の分離が必要であれば
必要な匹数揃えるのにも時間がかかるでしょうし。

(無題)

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No.2971-11 - 2014/04/18 (金) 09:00:28 - L

野生型との交配をはさまない場合のgenotypingについては、それぞれのCreに特異的なprimerを設計するのが正しいと思いますが、もし手持ちのprimerが二つのCreを区別できないものだった場合の横着な方法としては、

（１）Nestin-Creの発現がない事が確実な組織からサンプルを取る
（２）目的遺伝子のgenotypeが+/-もしくは-/-のマウスは、CAGCre+と見なして除外
（３）flox(unrecombined)アレルが検出されたマウスのうち、Cre+のマウスが、サンプル（flox/-;NestinCre+)とコントロール（flox/+;NestinCre+）になります。

もしgenotypingで用いる組織でNestinの発現がある場合はこの方法は使えません。また、CAG-Creによるfloxアレルのrecombinationがmosaicの場合も駄目です。（Nestin-CreもCAG-Creも使った事がないので、ここは不確かです。）ちょっと、危ないかな。

(無題)

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No.2971-10 - 2014/04/18 (金) 06:27:37 - L

野生型との交配をはさまない場合は、

flox/+;CAGCre+(=+/-;CAGCre+) x flox/flox;NestinCre+

という掛け合わせになります。生まれてくるpupsのgenotypeは、

（１）目的の遺伝子については、flox/+:flox/- = 50:50

（２）Creについては、CAGCre+NestinCre+, CAGCre+NestinCre-, CAGCre-NestinCre+, CAGCre-NestinCre- の４通りでそれぞれ２５％です。(ふたつのCreが異なるchromosomeにのっている前提で。）

CAGCre+のマウスのfloxはKOになってしまうので、最終的にflox/+;NestinCre+とflox/-;NestinCre+がそれぞれ12.5%になり、残りは+/-, -/-, NestinCre-のいずれかになります。

Littermateでサンプルとコントロールをとりたい場合は、ちょっと厳しいかもしれません。異なるlitterでよいのであれば、いけると思います。

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No.2971-9 - 2014/04/18 (金) 02:37:44 - 浅学者

AAさん、Lさん

コメントいただきありがとうございます。

＞特にCAG-CreマウスはTgマウスでCre遺伝子内の配列で遺伝子型判定をすることが多いかと思いますのでNestin-Creと混ざると分離が面倒臭そうです。

私はこの辺りの常法というものがありませんが、PCRによるジェノタイピングではCAG-CreとNestin-Creを区別できるようなプライマーを用いれば一世代野生型マウスを交配する必要も無く、またNestin-CreマウスとCAG-Creマウスが混ざる危険性も防げるのではと思うのですが、それは可能なのでしょうか？

つまり安全のため一世代野生型と交配させると数ヶ月待たねばなりませんが、特異的なプライマーを注文すればそれはしなくてもよいのでは？ということなのですが、特異的なプライマーの設計が難しいだとか、プライマーの特異性に保証がないから、という理由だからなのでしょうか？

こういったことまで論文に書かれてありませんが、素朴な興味として再度ご教授いただけますと幸いです。

(無題)

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No.2971-8 - 2014/04/17 (木) 23:14:23 - L

flox/+ CAGCre+マウスそのものを使うと、次の世代の半分はCAGCreを持ったままになり、Nestin-Creのconditionalの意味がなくなってしまうので（それでも残りの半分のCAGCre-マウスを用いればいけるとは思いますが）、flox/+ CAGCre+ マウスを一回野生型とかけて、+/- CAGCre-マウスを作ってからflox/+ Nestin-Creと掛け合わせた方が良いかもしれません。

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No.2971-7 - 2014/04/17 (木) 21:12:51 - AA

flox;CAG-Creマウスの配偶子は欠損型になるので
それをconventional KOとして維持すればよいかと思います。
毎度毎度floxとCAGとかけていると、
f/-;Nestin-Cre;CAG-Cre　(全身でKO)
というトリプルトランスジェニックができそうです。
特にCAG-CreマウスはTgマウスでCre遺伝子内の配列で
遺伝子型判定をすることが多いかと思いますので
Nestin-Creと混ざると分離が面倒臭そうです。

(無題)

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No.2971-6 - 2014/04/16 (水) 08:50:40 - 浅学者

みなさまご回答いただきありがとうございました。

大変申し訳ありませんが論文の提示は控えさせてください。

conventionalマウスはおりませんので、おそらくCAG-Creマウスとflox/floxマウスとをかけあわせ、

-> flox/+, CAG-Cre+マウス（全細胞においてヘテロ。以下+/-マウスとする）をタイピングにより選択

+/-, CAG-Cre+マウスとflox/flox, Nestin-Cre+マウスを掛け合わせ、

-> flox/-, Nestin-Cre+マウスを選択（Nestin陽性細胞でホモアリルとなり、それ以外の全細胞ではヘテロになる。）

という理解でいいんですね。ありがとうございます。
また、この際のコントロールマウスとして最も相応しいのは、flox/+, Nestin-Cre+マウスになりますね。ありがとうございます。よくわかりました。

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No.2971-5 - 2014/04/16 (水) 08:01:01 - Harmonia

> floxマウスを使って、神経細胞におけるあるタンパク質の機能を研究している論文

何の何巻何ページ？
ここに出しても問題無いんじゃない？

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No.2971-4 - 2014/04/15 (火) 20:26:59 - L

ConventionalのKOがあれば、そのヘテロのマウスを使えばいいし、なければ、germ cellでactive（specificである必要はない）なCreのラインとfloxをかけてヘテロのマウスを作る。このヘテロとfloxを掛けあわせる。

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No.2971-3 - 2014/04/15 (火) 12:47:04 - re

普通は論文に書いてあるかreferenceに書いてあるはずなのですが、+/-マウスがfloxedマウス由来ではなく、普通のノックアウトの可能性はありませんか？