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培養法ありがとうございます 削除/引用 No.2960-6 - 2014/04/28 (月) 17:22:57 - AID Lさん 　培養のことについて教えていただいてありがとうございます。 クリプトの状態で2-3日培養して、その後FACS解析でリンパ球を除いた解析が できればいいかなと考えております。 　 　また組織そのものを培養している報告もありましたので、24時間ぐらいならできるのかなと考えております。

(無題) 削除/引用 No.2960-5 - 2014/04/25 (金) 08:02:20 - L 培養については、現時点で一番エレガントと思われる方法は、Hans Cleversのラボで開発された、3Dのorganoid培養（マトリジェルにEGF、Noggin、R-spondinを加えた培地で、クリプトあるいは純化した腸上皮幹細胞を培養する）になると思います。ただ、alphaさんが仰っているように、コストがかかりますね。 2-3日培養できれば良いのであれば、クリプトの状態（シングルセルにしない）での通常の液体培養でも、クリプトがプレートに付着してクラスターを形成します。ただし、この場合はソートや磁気ビーズによる選択ができないので、腸上皮間リンパ球がコンタミしてると思います。また、実際培養するとー週間ほどで腸上皮クラスターの間を埋め尽くすように線維芽細胞が増殖してくる事が多く、腸上皮特異的なアッセイには不向きかもしれません。

ご回答ありがとうございます。 削除/引用 No.2960-4 - 2014/04/24 (木) 13:38:18 - IEC Lさん、alphaさん 　貴重なアドバイス、ありがとうざいます。 見ていてくれているんだなと思うとうれしいです。 　このフォーラムいいですね。 これから、いろいろ利用させていただこうと思います。

(無題) 削除/引用 No.2960-3 - 2014/04/20 (日) 00:38:27 - L シングルセルで回収したいのか、クリプトとして回収したいのかによって、方法が異なるのですが、EDTA/DTTの場合は、クリプトの分離になります。メッシュの穴のサイズにもよりますが、クリプトはメッシュに引っかかってしまうかもしれません。一部シングルセルあるいはクラスターとしてクリプトからはがれた細胞（死細胞を含む）が、粘液などと一緒になってメッシュを通過した結果、とろとろになったものが取れちゃっている気がします。最終的にソートによる分離を考えているのであれば、シングルセルで回収する必要があるので、EDTA/DTT/PBSでクリプトを回収後、前の方がおっしゃっているように更なる酵素処理を追加する必要があります。メッシュについては、酵素処理後に通した方が良いと思います。 なお、EDTA/DTT/PBSにFCSを入れると、FCS内のCaなどの陽イオンが入ってしまうので、目的から考えるとよくないように思います。RPMIについても同様です。Collagenaseなどの酵素は、逆にCaが必要で、かつFCSによる阻害を受けないので、酵素処理についてはFCSを含むRPMI内で行った方が良いように思いますよ。

(無題) 削除/引用 No.2960-2 - 2014/04/16 (水) 20:05:48 - alpha 以前、こちらでこんな論文があることを教えて頂きました。 Gastroenterology 141, 1762-1772, 2011 Nature Medicine 18, 618-623, 2012 私は、何度か試して上手くいきましたが、コストがかかり過ぎるのでやめました。 もう少し、安価で実施可能であることが判明したら着手しようと思っています。 ドロドロしているのは組織だと思いますよ。 単離だけでしたら、お示しのプロトコールに、コラゲナーゼやディスパーゼで組織を溶解しています。 この方法で生存率は90%前後ですね。 上皮マーカーはCD326とか使用していますが、割と多く使用されているような気がします。 CD326陽性CD45陰性細胞を検出して純度が、95%以上は得られると思いますよ。 培養方法は私も知りたいです。 基本的に培養は難しいので、株化細胞を用いることで対応しています。 いずれは、培養したいですけど。。。

マウス大腸上皮細胞の採取と培養法 削除/引用 No.2960-1 - 2014/04/11 (金) 10:12:31 - IEC マウスの大腸上皮細胞の採取の仕方を教えてください。50ｍｌチューブに5ｍM EDTA, 5％FCS 入りPBSを10ｍｌ入れて、この中に縦に切り開いた大腸(1匹分）を1cm ぐらいに切ったもの入れて、チューブを横にして、37℃の振とう器で、30分2回、100rpmにして回収しているのですが、メッシュを通して遠心してもトロトロ成分(たぶん死細胞）が多く、50％ぐらいの生存率です。トロトロ成分をなくす方法と生存率を上げる方法を教えてください。0.1ｍM DTTと15ｍM HEPESを加えても同じでした。RPMI1640を使った方がいいのでしょうか？溶液のvolumeを40mlぐらいにしたほうがいいのでしょうか？振とうしないでインキュベーターに静置してもいいのでしょうか？今は、CD45ネガティブセレクションで、死細胞はある程度除去できるのですが、パーコールなどで除去できるようでしたら、その方法も教えてください。 また、2-3日でもいいので、培養できる方法を教えてください。特別な培地が必要でしょうか？また、CD45ネガティブ細胞を上皮細胞としているのですが、フローサイトで使えるような腸管上皮細胞のマーカーがありましたら教えてください。 ここ2-3ヶ月ほど悩んでおりますので、どうぞよろしくご教示のほどお願いいたします。

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