BioTechnicalフォーラム [核内タンパクの免疫共沈降について]

核内タンパクの免疫共沈降について

No.296-TOPIC - 2012/03/15 (木) 17:53:28 - たろうちゃん

　いつも勉強させていただいております。
　
　免疫沈降の初心者であり、核内タンパクの相互作用について調べておりますが、うまくいきません。どなたかご教示宜しくお願いします。

　タンパクAにHisタグを入れてタンパクBにFlagタグを入れて293細胞で両タンパクを強制発現しております。その後His抗体で免疫沈降してFlag抗体で検出する方法をとっております。

　His抗体で免疫沈降するとタンパクAが十分に落ちてきていますが、タンパクBが全く検出されません。もちろんポジコンも入れておりますが、それでも検出できません。
IP前の上清みおよびIP後の上清みにタンパクAもBもあることは確認しております。
操作の途中で核たんぱくの結合が乖離していると思います。
　タンパクの抽出方法に問題があるのではと思いますが、いかがでしょうか？
いろいろ試しました。

HEPESとTritonX0.5％で細胞を混濁してSonicationをしたり、
LIPA buffferを混ぜるのみにしたりしましたが、うまくいきませんでした。

SonicationやLIPAは相互作用をはずす可能性があるという文を見ました。
どなたか核内タンパクの相互作用を見るときのお勧めのタンパク抽出法やLysis bufferなど教えていただけないでしょうか？

またはアドバイスなどでも結構です。

何卒宜しくお願いします。
　

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ご返信ありがとうございます。

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No.296-4 - 2012/03/17 (土) 11:31:56 - たろうちゃん

　ご意見ありがとうございます。
大腸菌で合成したタンパクAとBがどの程度結合するのかという実験はしておりません。しかし、ある論文でタンパクAとBが結合する核内タンパクであるという実験がありましたので、現在その再現実験をしているところです。

　その論文では明らかにLysis bufferとしてSDSの入ったおそらくRIPAバッファーと思われるin vitroの系でタンパクAとBが結合しているのがはっきりWBで示されていました。正直RIPAでそんなにきれいなバンドがでるのかとかなり懐疑的でしたが、その組成でやってみると全くバンドが出ませんでした。

ソニケーションは核膜を破ることと、DNAを切ることを目的としております。

　ご指摘通り、一度高塩濃度でやってみるようにします。クロマチンに強く結合しているタンパクなどの場合にはやはりソニケーションやDNAase処理などをしてクロマチンを破壊しないと、タンパク回収の効率はかなり悪くなるものなのでしょうか？

(無題)

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No.296-3 - 2012/03/17 (土) 10:02:52 - モモ

核蛋白の共沈実験している論文なんて探せばすぐに見つかりそうですが・・・

RIPAは共沈には向かないでしょう。界面活性剤が強すぎますよね。

ソニケーションはゲノムDNAを切断するためですか？DNAseで代用できませんか？

基本は界面活性剤に TritonX-100 または　NP-40を使って、NaClの濃度を高めにすることでしょう。界面活性剤の濃度と塩の濃度は試行錯誤が必要ですが。目的の蛋白が十分に抽出できる最低ラインを試すのが一番期待できそうです。

(無題)

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No.296-2 - 2012/03/15 (木) 19:40:37 - Harmonia

くっつくという前提で話されていますが、くっつくんでしょうか？
大腸菌で発現させて、タンパク質がたっぷり手中にありますか？
それで実験して、A何モルでB何モルが落ちてくるでしょうか？

核内タンパクの免疫共沈降について

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No.296-1 - 2012/03/15 (木) 17:53:28 - たろうちゃん

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