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(無題) 削除/引用 No.295-5 - 2012/03/17 (土) 09:42:46 - 初心者 返信ありがとうございます。 ＞カイさん 同じ体験をした方がいて少し安心しました。 現在使用している抗体はpro-caspase-3及びcleaved caspase-3の両方を認識する抗体を利用しております。 pro-caspase-3の方なんですが、誘導時間がながくなると徐々にバンドが薄くなっていくといった結果でした。ですので、「pro-caspase-3のバンドではきちんと細胞死誘導されてる感じなのにおかしいな」と思い、今回の投稿に至りました。 そうなると、cleaved caspase-3のバンドが薄くなる原因てのは一体なんでしょうかね。 今後は、cleaved caspase-3のバンドが１番見えやすい時間で実験を組んでいくことにします。

(無題) 削除/引用 No.295-4 - 2012/03/16 (金) 19:11:39 - カイ これは私も似たような経験があります。 プロジェクトを始めて手探りでやっていたころですが、 私の場合はH2O2刺激5分、その後もとの培地に戻してから8時間培養したものでは刺激なしに比べ、Cleaved caspase-3のバンドが見え、pro-caspase-3のバンドは薄くなるという結果だったのですが、 同じ実験をH2O2刺激5分、その後もとの培地に戻して19時間培養したものでは、刺激なしはpro-caspase-3が見えるのですが、刺激ありのほうではpro-caspase-3もcleaved caspase-3も見えなくなった、という結果になったことがありました。 両条件とも、刺激なしや、刺激あり＋上流のある分子のインヒビターあり、刺激あり＋上流のある分子のノックアウトではpro-caspase-3はそのまま濃く残っていて、話は通ります。 が、pro-caspase-3も見えなくなるんじゃ、刺激しすぎでcleaveされすぎてなくなってしまったのかなー、長すぎたかなー、ということでまぁ活性化を見る最適なタイムコースがあるんだろう、と。 以後いろいろ条件を検討した結果、caspase-3の活性は6時間で見ようということにして、フローサイトメトリーやcaspase-3の活性検出など他のメソッドでも裏を取って上流下流をいろいろ調べて論文にして…結局ウェスタンのデータは載せなかったな… もしcleaved caspase-3の抗体を使っていて、まだpro-caspase-3のほうは見てなかったら、見てみたらいかがでしょうか。pro-caspase-3とcleavedとが2本見える抗体とか。

(無題) 削除/引用 No.295-3 - 2012/03/16 (金) 13:41:26 - 初心者 返信ありがとうございます。 ＞細胞の形態や、内部標準はどうなのでしょう？ 浮遊系の細胞では、小さな小胞がだまになっていました。付着系では細胞がだまになって浮いていました。 また、内部標準は変化がありませんでした。 内部標準に変化がなかったので回収時のロスのことは、考えていませんでした。

(無題) 削除/引用 No.295-2 - 2012/03/15 (木) 19:02:44 - JIn 細胞の形態や、内部標準はどうなのでしょう？ ぱっと思いつくのは、アポトーシスの誘導時間が長く、 小さくプカプカな細胞をを回収時にロスしているのでは、ということです。

活性化caspase-3について 削除/引用 No.295-1 - 2012/03/15 (木) 16:06:26 - 初心者 いつも拝見させて頂いております。 現在、アポトーシス実験でcaspase-3の活性化をウエスタン解析しています。 その際、活性化caspase-3のバンドは検出されるのですが、 FAS抗体によるアポトーシス誘導時間がながくなるにつれて 活性化caspase-3のバンドが薄くります。（他の刺激は何も加えておりません） この原因を調べているのですが検討がつきません。 なにか情報をお持ちになられている方いらしましたら教えてください、お願いします。

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