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(無題) 削除/引用 No.2943-10 - 2014/04/06 (日) 09:36:00 - ラット三昧 こさん コメントありがとうございます。 アイソタイプのコントロールは毎回置いていたので、ひとまずサイトカインと中和抗体を培地中で混ぜ、一定時間置いたものを細胞にかけてみようと思います。 抗原-抗体の方がリガンド-受容体よりも早く相互作用するだろうとの思いこみが裏目に出たのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.2943-9 - 2014/04/06 (日) 09:09:34 - こ >[Re:8] ラット三昧さんは書きました : > 一定時間前処置と書いていますが、サイトカイン入り培地の5分前に抗体を添加している程度です。 すでに指摘されているように、最初に抗体とIL6を混ぜていないので、抗体とレセプターへのIL6の結合が競合するために効果が薄いのでしょう。 あと、5分というのも少し短い気もします。抗原抗体反応は出会ってしまえば早いですが、5分で平衡状態なるか疑問です。15分とか30分インキュベートした方が無難だと思います。 成功するかは別として、IL6と特異抗体およびisotype controlをインキュベートして添加するのが理想的な方法だと思います。

(無題) 削除/引用 No.2943-8 - 2014/04/06 (日) 02:55:23 - ラット三昧 TK-1様 一定時間前処置と書いていますが、サイトカイン入り培地の5分前に抗体を添加している程度です。ご指摘のようにサイトカイン添加までwell中に抗原はほぼないので、抗原が添加され次第抗体が結合できる状況かと思いますが、事前の抗体添加が実験結果を左右するとは余り考えていませんでした。 サイトカイン側を中和する、というのは難しいのですね。

(無題) 削除/引用 No.2943-7 - 2014/04/06 (日) 02:19:46 - TK-1 > 早速のコメントありがとうございます。下記は、細胞とサイトカイン側の抗体をプレインキュベートしても標的タンパクと相互作用するわけではないから、でしょうか？？ > IL-6と抗体を培地中で混和したものを細胞に添加するべきでしょうか。 サイトカイン側の中和は結構難しいです。下手すると逆効果になるので。 > 以前LPSのシグナルをポリミキシンで止めるときにはこの方法で出来ていたので、同様にやってもできるかな、、と考えていました。 LPSのシグナルを止めるのにポリミキシンと細胞をプレインキュベートしてからLPSを加えたということですか？ > アッセイ方法について追記です… > 細胞に、中和抗体を溶解した培地を添加して一定時間インキュベート > →さらにIL-6入り培地を添加しています。 この方法がどういう原理で働くと思うのか説明してください。何故抗原がないところで一定時間インキュベートする意味があるんですか。

(無題) 削除/引用 No.2943-6 - 2014/04/06 (日) 01:22:35 - ラット三昧 oasis 様 コメントありがとうございます。予備実験で細胞に添加するIL-6濃度を複数振って、 dose responseの見える真ん中の濃度を使っています。 抗体濃度についても、公比を広く取って5濃度ほど評価しています。 上記のIL-6濃度で評価可能と判断するためのポジコンとして、受容体であるgp130のノックダウン群を設定して、STATのリン酸化が抑制されることは確認しています。

(無題) 削除/引用 No.2943-5 - 2014/04/06 (日) 00:43:21 - oasis il-6の最小濃度で行っていますよね。。？

(無題) 削除/引用 No.2943-4 - 2014/04/05 (土) 23:41:50 - ラット三昧 アッセイ方法について追記です… 細胞に、中和抗体を溶解した培地を添加して一定時間インキュベート →さらにIL-6入り培地を添加しています。

(無題) 削除/引用 No.2943-3 - 2014/04/05 (土) 23:30:42 - ラット三昧 >TK-1様 早速のコメントありがとうございます。下記は、細胞とサイトカイン側の抗体をプレインキュベートしても標的タンパクと相互作用するわけではないから、でしょうか？？ IL-6と抗体を培地中で混和したものを細胞に添加するべきでしょうか。 以前LPSのシグナルをポリミキシンで止めるときにはこの方法で出来ていたので、同様にやってもできるかな、、と考えていました。 >この方法ではreceptorのブロッキング抗体はテストできても、サイトカインの中和抗体のテストは無理かも知れません。

(無題) 削除/引用 No.2943-2 - 2014/04/05 (土) 23:02:24 - TK-1 > なお、抗体の阻害活性は下記要領で評価しています。 > ラット肺胞マクロファージ細胞株NR8383を抗体で前処置し、リコンビナントIL-6とポリミキシン（コンタミLPSの影響を排除）を添加。一定時間後のSTAT3リン酸化をウエスタンで検出しています。 この方法ではreceptorのブロッキング抗体はテストできても、サイトカインの中和抗体のテストは無理かも知れません。

ラットIL-6の中和抗体 削除/引用 No.2943-1 - 2014/04/05 (土) 22:25:48 - ラット三昧 いつも参考にさせていただいております。ラットを用いて in vivo での IL-6 の働きをブロックできるような IL-6 或いは IL-6R 中和抗体をご存知の方がいらっしゃいましたらご紹介願います。 これまで複数の抗ラット IL-6 抗体（neutralize の記載あり）を試しましたが、うまく働くものに出会えていません。 なお、抗体の阻害活性は下記要領で評価しています。 ラット肺胞マクロファージ細胞株NR8383を抗体で前処置し、リコンビナントIL-6とポリミキシン（コンタミLPSの影響を排除）を添加。一定時間後のSTAT3リン酸化をウエスタンで検出しています。 おすすめ抗体、および抗体評価法の改善点もありましたら、是非ご教授ください。 よろしくお願いいたします。

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