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(無題) 削除/引用 No.2939-15 - 2014/04/06 (日) 05:12:59 - U すいません。やはりAを染めた後、非固定でCD11c/classIIを染色するのはまずいと思うので、もし固定前後でCD11c/classIIの染色パターンが変わってしまうようなら、Aの抗体をbiotinで標識した方が確実（感度も上がる）と思います。二転三転してごめんなさい。

(無題) 削除/引用 No.2939-14 - 2014/04/06 (日) 04:43:09 - U OKさん その染色プロトコールだと、死細胞の除外を目的としたPI染色は外した方が良いと思いますよ。1%PFAでどのくらい色素排出能が影響されるか、やった事がないので分かりませんが、ひょっとすると、G2/Mの細胞を死細胞として除外する事になっているかもしれません。 また、固定後の細胞表面マーカー染色は、ものによってはあまり信頼できない場合もあるので、非固定と固定後でCD11c/classII染色に差があるかどうかは確認しておいた方が良いように思います。これもやった事がないので分からないのですが、FITC標識２次抗体でAを染めた後、非固定でCD11c/classIIを染めてみるのはだめですかね？

(無題) 削除/引用 No.2939-13 - 2014/04/06 (日) 03:56:52 - OK U様 コメントいただきありがとうございます。 > フローサイトメトリーでの検出という事は、Aは細胞表面に発現する膜タンパクで、DCでの発現というのは、CD11c陽性細胞におけるAの細胞表面での発現という理解でいいですか？ はい、おっしゃる通りです。 > この場合、他のCreでノックアウトした別の細胞での結果も、同様にフローサイトメトリーでの結果でしょうか？この結果から抗体の特異性を推測するには、同じ実験系である必要があると思います。 はい、別の血球系細胞特異的に飛ばし、フローサイトメトリーにて同様に検討しました。 > また、例えばその抗体が、CD11c陽性細胞でのみ発現する他の膜タンパク質（仮にBとします）と交差反応する場合は、Bを発現しない他の細胞のノックアウトでは予想通りに出るけれど、CD11c陽性細胞ではBを検出してしまうため、ノックアウトされてないように見える可能性もありますね。 その可能性はあるんですよね。。グローバルのノックアウトが致死なので最後までその可能性は残ってしまいそうです。もちろんノックアウトの細胞でタンパク質Aが発現していると思われるDCとしていないDCをソートして、メッセージやタンパク質を見る事は可能です。 ２種類の抗体を試されたとの事ですが、どちらもモノクローナルで、Aの異なる部位を認識するものでしょうか？その抗体がFabでない場合は、FACSの際にFcブロックをかけてますか？ はい、いずれもモノクロです。ただ、エピトープマッピングはされていません。それはAを発現した細胞をラットにそのまま免疫して作成したものであるからです。また、そのAに対する抗体（whole IgGです。）がビオチンあるいは蛍光で直接標識されていないため、染色方法が実はトリッキーなんです。 脾臓細胞の回収 ー＞溶血 ー＞タンパク質Aに対する抗体またはアイソタイプ抗体で染色 ー＞洗浄後、FITC-anti-Rat IgGで染色 ー＞洗浄後、1% PFA, 10 min固定 ー＞洗浄後、PE-anti-MHC-II, PE-Cy7-anti-CD11cで染色 ー＞洗浄後、PIで染色 ー＞洗浄後、LSR-IIにて解析 です。タンパク質Aに対する抗体、PE-anti-MHC-II, PE-Cy7-anti-CD11cこの三つが全てラット由来のため、リネージで染める前に、PFAでの固定を行っています。 > FloxアレルによってCreに対する感受性は異なりますので、ROSA reporterで組換わるからと言って、OKさんのfloxでも組換わるとは限りません。 興味深い考察をありがとうございます。 CD11c-Creマウスがよく使われているからといって、私達のFloxedマウスでも同等に効率よく飛ばせるとは限らないということですね。それは知りませんでした。まずはPCRで確認してみます。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.2939-12 - 2014/04/06 (日) 03:44:02 - OK あ様 引き続きコメントありがとうございます。 > KOでシグナルが無くなるなら抗体は特異的なのではないでしょうか。 別のlineageの細胞／組織で飛ばしたので、交差反応をするタンパク質がそのlineageで発現していないからシグナルが見えないのか、それとも特異的なのかが現時点では判断できません。 私はCD11c+, MHC-II+, PI-にゲートをかけましたが、あ様がおっしゃられるように他のlineageマーカーネガティブも追加でゲートすることも解決の一つの方法ですね。ありがとうございます。 ぜひ検討してみます。

(無題) 削除/引用 No.2939-11 - 2014/04/05 (土) 18:38:25 - U フローサイトメトリーでの検出という事は、Aは細胞表面に発現する膜タンパクで、DCでの発現というのは、CD11c陽性細胞におけるAの細胞表面での発現という理解でいいですか？ この場合、他のCreでノックアウトした別の細胞での結果も、同様にフローサイトメトリーでの結果でしょうか？この結果から抗体の特異性を推測するには、同じ実験系である必要があると思います。 また、例えばその抗体が、CD11c陽性細胞でのみ発現する他の膜タンパク質（仮にBとします）と交差反応する場合は、Bを発現しない他の細胞のノックアウトでは予想通りに出るけれど、CD11c陽性細胞ではBを検出してしまうため、ノックアウトされてないように見える可能性もありますね。２種類の抗体を試されたとの事ですが、どちらもモノクローナルで、Aの異なる部位を認識するものでしょうか？その抗体がFabでない場合は、FACSの際にFcブロックをかけてますか？ FloxアレルによってCreに対する感受性は異なりますので、ROSA reporterで組換わるからと言って、OKさんのfloxでも組換わるとは限りません。他の方も言っているように、CD11c陽性細胞での組替えを、PCRなりサザンなりで確認する必要はありますね。

(無題) 削除/引用 No.2939-10 - 2014/04/05 (土) 15:04:05 - あ KOでシグナルが無くなるなら抗体は特異的なのではないでしょうか。 DCを精製しても純度が十分高くないとコンタミ細胞由来のシグナルが検出されます。BMDCでもCD11c精製しないとうまく行きません。純度が低いままウエスタンをするとノックアウト細胞のレーンでバンドが当然出るのですが、知らないと結構ショックを受けます。私は精製度を上げて解決しました。 脾臓細胞を染めてFACSする場合も、DC以外の細胞をきちんと分離できていないとポジティブに見えます。そこがちゃんと出来ているかなと思った次第です

(無題) 削除/引用 No.2939-9 - 2014/04/05 (土) 10:03:09 - OK あ様 コメントいただきありがとうございます。 すぐに使えるマウスが９ヶ月齢のものでしたので、とりあえずは発現の確認用に使いました。 今後、8-10週齢のマウスで再度解析する予定です。 あ様が使われていたマウスは問題ありませんでしたでしょうか？ DCではわかりませんが、他の組織特異的に飛ばしたマウスでは今回用いた抗体はきれいに反応しませんでしたので、特異的なものであると期待しています。残念ながらグローバルなノックアウトでは致死になってしまいます。

(無題) 削除/引用 No.2939-8 - 2014/04/05 (土) 08:07:49 - あ CD11c-Creの文献は10週齢程度のの若いマウスを使っていると思います。私もその位のを使ったのですが、9ヶ月のマウスのというのは４０週齢位ですよね。そこまで週齢が増えたマウスで試した論文はありますか？一度10週齢前後の若いマウスで試されたほうがいいかと思います。

(無題) 削除/引用 No.2939-7 - 2014/04/05 (土) 03:00:23 - OK 独り言様、あ様 コメントいただきありがとうございます。 脾臓からの樹状細胞はMHC-II+, CD11c+で濃縮することができますので、一度sortingを行い、recombinationを確認してみます。 >Rosa26-Creなど別のCreのTgと交配した場合は組み換えは起こるのですか？ 別のCreのTgマウスではきちんと組み替えが起こる事を確認しています。 Creのpromoterのメチル化などはあまり見られない現象なのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2939-6 - 2014/04/05 (土) 02:56:20 - OK AA様 コメントいただきありがとうございます。 いえ、まだメッセージレベルでは発現の確認はしておりません。抗体の特異性も疑っているのできちんとメッセージを見るべきですね。次回ソートする際に行ってみます。それによって抗体の特異性やタンパク質の寿命についてもわかりそうです。 CD11cCreマウスとレポータマウスとの交配はすでに行われています。(PMID: 23284905) CD11cCre BAC TgマウスでもCD11c+細胞においてレポーターを発現しているようです。 ご指摘いただいたように、まずは自らの手で確認してみます。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.2939-5 - 2014/04/04 (金) 17:30:26 - あ このCD11c-Cre Tg-lineを使った論文はたくさん出ていますし、以前この系統と交配したことがありますが、JAXではありませんが、組み換わりました。 脾臓細胞の中で樹状細胞が正しくゲートできているのでしょうか。 CD11c+細胞をMACSカラム等で精製するか、BMDCを使って発現と組み換えを調べらるのがいいと思います。 Rosa26-Creなど別のCreのTgと交配した場合は組み換えは起こるのですか？

(無題) 削除/引用 No.2939-4 - 2014/04/04 (金) 16:56:54 - 独り言 とりあえず、お作法どおりゲノムの組み替えが起こっているかPCRなどでみるべきです。 それとも樹上細胞を集めるのは大変なんしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2939-3 - 2014/04/04 (金) 11:23:18 - AA RT-PCRなどでmRNAレベルでは目的遺伝子の欠損を確認されましたか？ タンパクのターンオーバーが極端に長いなどの場合でも 組換が起きているかどうかは確認できます。 CD11c-Creを使ったことがないのでわかりませんが、 蛍光レポーターマウスと交配してFACSしている報告などはあるのでしょうか？ BACのTgマウスであれば発現が本来のCD11cと一部異なることがあります。 目的の細胞で本当にCreが発現しているかどうか、 まずCreの存在をタンパク/RNAレベルで確認されると良いかと思います。

(無題) 削除/引用 No.2939-2 - 2014/04/04 (金) 10:52:00 - OK 誤りがありました。 9週齢のマウスではなく、9ヶ月のマウスです。 申し訳ありません。

Cre-LoxP systemでタンパク質が消失しない原因について 削除/引用 No.2939-1 - 2014/04/04 (金) 10:49:27 - OK いつも勉強させていただいています。 今回、私が抱える問題について皆様からのコメントをいただければと思い、このトピックを作成しました。 現在、JAXラボより購入したCD11c-Creマウス(#008068)と私たちの興味ある遺伝子Aのfloxedマウスと交配させ、そのマウスおよびlittermateのマウスを使用し、樹状細胞 (DC) におけるタンパク質Aの発現をフローサイトメトリー(LSR-II)にて確認することを行っています。 マウス週齢は9ヶ月以降の♂マウスが利用できたので、それを使用しました。 手順は脾臓を取り出しシングルセルにした後に赤血球溶血バッファーにて溶血後、抗体染色を行い、最後にPIで染色したものを解析しています。 その結果、DC特異的なノックマウスにおいても、littermateと変わらずシグナルが検出されてしまいました。抗体の特異性を疑い、市販で論文でも実績のある２種類を試してみましたが、結果は変わらずでした。 可能性として以下を考えています。 1. タンパク質Aに対する抗体の特異性が低い可能性 2. Genotypeに使用するprimerが、CD11c-Creではなく別のCreのprimerである可能性 3. JAXラボより購入したCD11c-Creマウスが、CD11c-Cre-ERの可能性 4. タンパク質Aの寿命が極めて長い可能性 5. CD11c-Cre 遺伝子座のプロモータのメチル化などのepigeneticな発現抑制の可能性 6. undeleted cellによる代償増殖によりpopularityがrecoveryした可能性 を考えています。まだあるかもしれません。。 1に関してはその可能性は残っていますが、別の組織で別の細胞なのですが、タンパク質Aを飛ばした際にはその抗体はノックアウトマウスではきちんと発現が消えていることを確認しています。 2と3に関しては正しい事を確認しました。 4に関してですが、今回9週齢のマウスを用いたのでその可能性は極めて低いものと考えています。 そこで私が皆様からコメントや助言をいただきたいのは、可能性5と6についてです。 知人から興味深いことをお聞きしました。ある組織特異的Creを発現するマウスとRosa26-floxed STOP-蛍光タンパク質を持つマウスを掛け合わせ、ある組織で蛍光タンパク質を持たせるレポータマウスを作ったところ、年老いたマウスで3年間の内、過去2度ほど蛍光タンパク質が発現しないマウスがいたそうです。genotypeはあっていたようです。 そこで、aged miceではCreのプロモータのメチル化など起こりえるのではないかと思っています。 私はCre-LoxPマウスを使うのは今回が初めてでこれまで経験がありません。このようなことはよく起こるものなのか、もしそうだとすればどういったマウスで起きやすいのかを教えていただけないでしょうか？ また、６についてですが、このタンパク質は運動性を正に制御する機能を持っていますので、もしかしたらCreでdeleteされなかった樹状細胞が代償性に増殖してしまい見かけ上、野生型になっているのではとも考えていますが、やはり私に経験がないためCreのdeletion効率がわかりません。この点についてもご助言等いただけましたら幸いです。 どうかご教示、よろしくお願いいたします。

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