BioTechnicalフォーラム [Caco-2細胞のmonolayer]

Caco-2細胞のmonolayer

No.2934-TOPIC - 2014/04/01 (火) 23:03:53 - monolayer

Caco-2細胞をセルカルチャーインサート上で培養しています。
24well plateのスケールで細胞数は1.5x10^4/wellほどで播種し、5日くらいでコンフルエントになります。
その後さらに3週間培養して分化させるのが一般的だと思うんですが、コンフルエント後からだんだん細胞がmonolayerの上のほう？まで増殖してきて多層というか折り重なっているように見えます。
これではもはや単層とは呼べないような気がするのですが、これは細胞が変異してしまっているのでしょうか？
それとも培養条件がおかしいのでしょうか？
培地はDMEMに10%FBS、1%NEAAあとストレプトマイシンとペニシリンを入れたものを使用し、3日に1回交換しています。
TEERは安定せず培養日数にほぼ比例して増え続け、培養21日で1500Ω・cm2くらいです。

単層培養するのに他に何かコツとかあれば教えていただけるとありがたいです。
よろしくお願いします。
　

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(無題)

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No.2934-6 - 2014/12/12 (金) 16:51:34 - h

皆様のレスを見ました。
私もcaco2細胞の長期培養を行っています。

私もmonolayer様と同じような現象が起こっていました。そして、播種後10日前後で、細胞の輪郭が無くなり、いかにも細胞が栄養不足で死んだような像が得られました。caco-2細胞は長期培養の例がたくさんあるにも関わらず、このような現象が起こることはあるのでしょうか。

ちなみに、3 cmシャーレに播種して、培地交換はFR含有しているDMEM培地で培養していますので、色がまったく変わらない段階で2日おきに培地交換をしていました。

ご指導のほどよろしくお願いします。

(無題)

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No.2934-5 - 2014/04/02 (水) 22:44:19 - TS

カルチャーインサートのようなものに培養して
免疫染色後にカバーガラスで封入してコンフォーカルで観察すると
メンブレンが波打つので、綺麗に平らにはなりませんよ。
おっしゃるように、撮る時にはz軸方向のスライスをとっておくと良いでしょうね。
xz軸画像の再構築もできるし。そしたらいろいろわかるかも。

あるいは、カバーグラスや通常のフラスコのようなものに培養していると、
caco2は、水や電解質を基底膜側に輸送するので、ところどころに
ドームと呼ばれる、あたかも細胞が盛り上がったようになります。
溶液をため込むためにできる構造です。
これは分化の証なので問題ありません。
位相差で見てもその部分はフォーカスがズレるので、わかりますね。
もしかしたらそれのことでしょうか。
(カルチャーインサートではできませんが)

私は、いくつかの研究室でcaco2を使ったことがあり(現在進行形)、
また培養についての相談も受けたりしますが、
単層にならないcaco2にはであったことがないので、
重層にはそうそうならないのではないかと。
なっていたらかなりレアで、逆に面白いかも。
抵抗値が上がらないとかは、ときどき相談されますが。

抵抗値については、たぶん血清やハンドリングのせいでしょうが、
ラボによってかなり違いがあります。
1500Ωくらいまでなるところもありますし、
400Ωくらいでも、綺麗に実験ができているところもあります。

また21日後に実験しているところもあれば、14日目に実験するところもあります。
抵抗値、ALP、消化酵素など、何を基準に分化が安定したとするかにもよるし、
目的にかなえば良いと思います。
KIOさんの事例のように、培養期間に関してコメントしてくるレフェリーもいますが
論理的なデータがあって培養期間を設定していれば、大抵は納得してくれるのではないでしょうか(私も経験あります)。

がんばってください。

(無題)

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No.2934-4 - 2014/04/02 (水) 21:08:21 - monolayer

TS様

BioTechnicalフォーラムでCaco-2について調べていたとき、何件もTS様のレスを拝見しました。お詳しいようで助かります。

ConfocalでTJタンパク質を見たことがあるんですが、論文でよく見る格子状の細胞が単層になっている断面のように綺麗に撮影できず、ボコボコとしていて細胞の高さがまちまちでした。そのため、単層というよりは3次元的に増殖しているのかと思いました。3T3細胞のコロニー形成実験などを連想して、Caco-2もがん由来だからそういうこともあるのかな、と。

ただ、確かにきれいに撮ることばかり考えていたので細胞の層がどうなっているのかあまり気にしていませんでした。3Dで高さを多めにとってみれば判断できますよね。ありがとうございます。

KIO様

論文ありがとうございます。
確かに、培養条件はいろいろあるようですね。上記のように増殖のし過ぎ、と考えていたため、無血清は近々やってみようと思っていました。ざっと見た感じ、JPGN 1995, 20, 148-55は血清の代わりにIGF-1を使っているみたいですね。ただ、無血清だと分化が進まないみたいですね。これを”安定する”と捉えているのでしょうか？わかりません。

とりあえず、よく読んでみます。ありがとうございました。

参考までに（参考になる？）

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No.2934-3 - 2014/04/02 (水) 19:10:44 - KIO

Caco-2 cellsの扱いは厄介ですね。自分の調べた限りconfluentになってから２１日後というより播種してから２１日後に実験をしている場合が多いようですが。また
British Journal of Pharmacology 2002, 136, 280-6
によるとDay 8にserum-free mediaに交換、Day 14に分化が安定するとあります。ところが、その根拠としている論文
Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition 1995, 20, 148-55
を読むと、そのようなデータは明示されていません…（どういうこと？）
一方、
Nature 2011, 469, 543-7
では培養７－１２日後にTERが安定してから使用しています。
このような報告があり、かつ、分化が研究目的でなかったのでCaco-2 cellsを培養７日後に使用してデータを出し論文を投稿したら”Caco-2 cellsは２１日間培養してから使用すべし、そんなことも知らないのか”というようなコメントをもらってしまいました・・・（Methodsには培養７日後に使用した理由を書いておいたにも関わらず）。
ということでTERを測定することが目的ならNature 2011, 469, 543-7のような使い方が合理的ではあるのですが、分化を研究するなら２１日間培養するしかないのかもしれませんね、ともかくは。

(無題)

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No.2934-2 - 2014/04/01 (火) 23:48:39 - ＴＳ

コツは特にないですね。
トピ主さんの培養条件で問題ありませんし、
抵抗値も問題ない範囲内だと思います。

重なり合っているというのは、死んだ細胞が凝集してるのではないでしょうか。
caco2でも分化中でも多少は死にますから。
確かにそういう風に見えるというのはあり得ます。

多分大丈夫だと思いますが、
気になるのでしたら、何かを免疫染色とかしてコンフォーカルで単層を確認してはどうでしょうか。

Caco-2細胞のmonolayer

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No.2934-1 - 2014/04/01 (火) 23:03:53 - monolayer

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