全7件 ( 1 〜 7 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

ありがとうございました 削除/引用 No.2929-7 - 2014/03/31 (月) 13:41:09 - ファーマ たくさんのアドバイス、ありがとうございました。 「No.2929-3 - 2014/03/28 (金) 20:08:36 - 名無し」の御意見が、一番それっぽく思われます、、、なんとなくですが。 とにかく、必須的(常識的)な処理ではないようなので、少し安心しました(笑)。 また、現研究室では、ヒト由来抗原の自家製抗体をよく使用しています。抗体によっては、マウス・ラット由来サンプルに対する検出感度の弱い抗体もあります。 ですから、「おお」さんの言われるように、たまたま検出感度がよかったとかもあるのかもしれません。 しばらくは、ウェスタンのときに酢酸／メタ処理（ある、なし）を比べてみようと思います。 処理なしでも大丈夫そうなら、今後、「人間関係を考慮に入れつつご検討」することにします（笑）。 皆様、本当にありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2929-6 - 2014/03/30 (日) 09:39:07 - AP 固定処理としてやっているんでしょう。 これの一番下に、native gel blottingの手順として類似の処理の記述があります。 http://www.lifetechnologies.com/jp/ja/home/references/protocols/proteins-expression-isolation-and-analysis/western-blot-protocol/western-blotting-using-nitrocellulose-membranes.html 変性ゲルでもやって悪いことはなさそうです。

(無題) 削除/引用 No.2929-5 - 2014/03/29 (土) 12:29:22 - おお No.2929-3 - 2014/03/28 (金) 20:08:36 - 名無しさんの様なことの結果というのはあるかもしれませんね。 大抵は酢酸はなくてもいいですし、私の場合はトランスファーのバッファーに20%のメタノールがはいっているので、転写後水で洗えば事足りると思っています。 なぜ酢酸をいれるその方法にしたのかは、した人の理由をきかないとわからないかもしれません。たまたま扱ってた蛋白がその方が検出感度がよかったとかあるのかもしれません。 酸やアルコールは変性を促しますので、変性状態で膜上で特定のタンパク質は保持されやすいとか、抗体によってはその様にへんせいしてないと検出できないとか、膜上で起こるrenatureで検出感度が落ちるのをふせぐとか(実際にfar westernはこの性質を利用していて、膜でPBSTなどでインキュベーションするとrenatureは起こりやすいという主張もあります。かなりの蛋白がそこまで容易におこるとはおもえませんが)。一般論でなく特定のものならそう言う話もあるかもしれないと思いました。

(無題) 削除/引用 No.2929-4 - 2014/03/28 (金) 20:56:39 - うえ 転写バッファーにメタノールが入ってないなら、膜へのタンパク質の固定って意味で酢酸メタノール処理は必要かもしれませんが、転写バッファーにメタノールが入ってるならそれでタンパクがメンブレンに固定もされるので、やる意味はあまりないかと思います。 人によってはラボのプロトコールに従わないと面白くないと感じる人もいますので、今後同じ処理をするかしないかは人間関係を考慮に入れつつご検討ください。

追加 削除/引用 No.2929-3 - 2014/03/28 (金) 20:08:36 - 名無し これはたぶんの話なんだが、転写後に膜をポンソー3Rとかアミド黒とかの色素で染色すると転写された蛋白質が染まるんで、そうやって転写状態を確認してからimmunodetectionに行くということをする人もむかしはいて（ブロッティング装置や膜がいまほど良くなかったので）、その際、染色して確認後、脱色するときにそういった溶液を使うと思うので、たぶんそれの名残で、染色してもいないのに、脱色液の中で振ってるとかじゃないかな。目的が忘れられて、方法だけが残ったとかみたいな感じ。

(無題) 削除/引用 No.2929-2 - 2014/03/28 (金) 19:56:48 - 名無し 初めて聞くわ。別にやっても悪い事はないとは思うけど、すくなくとも一般的な蛋白質を対象とするならばあまり意味はないと思うので別にやらなくてもいいんじゃね。何でもそうだと思うけど、研究室でみんながやってるからとか、先生が言ったからとかいうのでなくて、やっぱ自分で本とか論文とかネットとかで調べて勉強して標準的な方法とか、特別なケースの場合の方法とか自分で探した方がいいよね。

ウェスタンのメンブレン転写後 削除/引用 No.2929-1 - 2014/03/28 (金) 19:27:43 - ファーマ どなたかアドバイス頂けると幸いです。 私は、マウス・ラットの血清や脳、肝臓などを主に扱っているものです。 現所属研究室のウェスタンの方法なのですが、タンク式で転写したあとにメンブレン(PVDF,ニトロセルロースのどちらも)を7%酢酸/10%メタノール液に15min浸しています。 その後、DW wash 5minx4回してから、スキムミルクでブロッキング処理をしています。 これ以外の操作手順は、私がこれまでに所属していた研究室でのウェスタン手順（参考書に載っているいる一般的な手順）とほぼ同じです。 この7%酢酸/10%メタノール液処理にはどのような意味があるのでしょうか？ 教室メンバーに尋ねても、昔からこうしていて理由は知らないとのこと、、。 タンパクのメンブレンへの固定がよくなるとか、タンパクがよりしっかりと変性されて抗体がくっつきやすくなるとか、何かあるのでしょうか。 どなたかご存知の方、おられますか？

全7件 ( 1 〜 7 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---