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ありがとうございました 削除/引用 No.2920-7 - 2014/05/14 (水) 16:11:40 - KS+ ありがとうございました。 ご報告が遅くなってしまってすみません! FACSにかける前にcell coverという製品で細胞を軽く固定する、 TrizolLSを使用する　 という方法でなんとかきれいなRNAをとることができました。 アドバイスありがとうございました。

Trizol　LS 削除/引用 No.2920-6 - 2014/03/27 (木) 18:13:15 - ema 微量の時はTrizol LSで（10-20％ボリュームまで血液などの液体用）でソート細胞をダイレクトに取るのが一番効率が良かったです。 RNAlaterはKS+さんが感じているように遠心時に問題がありますし、場合によっては白くにごったサンプルもありました。ちなみに組織とか小さくしぼんで硬くなって、さらに組成は酸性の溶液なのでそれに細胞をソート、って好ましくない気がします。 私は好酸球はあまりやってなかったので参考としてABIのページで ＜ユーザーズボイス1＞ 「好酸球研究とリアルタイムPCRシステム」 「国立三重病院臨床研究部　加藤佳子様 　私たちの研究室（臨床研究部長 藤澤隆夫先生）では好酸球研究を中心に行っています。 好酸球はRNase-richでしかも細胞同士が接着しやすい性質を持つため、抽出の途中でRNAが壊れやすいのが悩みです。私たちは好酸球のホモジナイズに超音波細胞破砕装置を利用するなど、独自の工夫をして対処していましたが、微量なRNAでのPCRには苦労していました。あるとき、他の研究室の方から「リアルタイムPCRでは5μgのRNAで解析出来る」と聞き、実際にアプライドバイオシステムズでサンプルを試験解析していただいたところ、確かにデータがでて、しかも反応曲線が目に見えるのでデータの信頼性が高く、私たちの中では画期的な意味がありました。

(無題) 削除/引用 No.2920-5 - 2014/03/27 (木) 17:54:09 - KS+ なるほど　もともととれるRNA量が少ないのですね。 ありがとうございます。 次回、数を増やしてとれる細胞数を増やす、 RLTもしくはtrizolに直接sortする の2点を試してみようと思います。 RNAlaterにsortするよりはRLTbufferやtrizolでsortした方がbetterですか？　 どちらにしようか迷っています。 RNAlaterだと比重が高くてかなりのgをかけて遠心しないと細胞が落ちなそうという問題があり、 RLTbufferだとその後カラムにapplyする液量に限界があるためその後何回も遠心する必要がでてくるのが難点かと考えています もしRNAlater　RLTbufferでsortした御経験がある先生いらっしゃったらアドバイスいたっだければ幸いです。

(無題) 削除/引用 No.2920-4 - 2014/03/27 (木) 02:31:01 - protein 私もDCなどのmyeloid cellsに比べてlymphocytesはかなりRNAが少ないように感じます。 もしRNaseの影響を疑っているのでしたら、 定番ですがlysis bufferやTRIzolに直接sortingするのが良いと思います。

(無題) 削除/引用 No.2920-3 - 2014/03/26 (水) 20:00:36 - KS+ ありがとうございます たしかにマクロファージだとしても数ng弱しかとれないことも多いので バイオアナライザーで確認もしています マクロファージ、その他の血球は品質もよいものがきちんととれて濃度測定できたにも関わらず　同様の方法でsort,抽出した好酸球は量が測定感度以下になってしまいました。 好酸球の方が壊れやすくRNAがとれないのかなと思ったりしています もっとたくさんの細胞数とれるように努力してみますが 他に臓器からの好酸球sortの方法、好酸球からのRNA抽出方法の留意点につき 提案があったら教えてください よろしくお願いいたします

妥当な量だと 削除/引用 No.2920-2 - 2014/03/26 (水) 12:43:37 - ema 10万個というと10５乗オーダーの細胞数ですよね。 分化したプライマリーの細胞は小さいので（マクロファージとかは大きいですが）pg-数ngオーダーしかRNAは回収できないと思います。 私の場合はナノドロップ（分光光度計）では検出限界以下のことが多いです。アジレントのバイオアナライザーのピコキットを使うとちゃんと品質的にも取れてるのが確認できました。 106乗-10７乗の細胞がもし回収できる実験系ならそちらをお勧めします。 でなければバイアスがかかってよいなら増幅をかませる、ですか。

マウス肺からsortした好酸球のRNA抽出 削除/引用 No.2920-1 - 2014/03/25 (火) 20:54:23 - KS はじめまして　 基礎研究をはじめて2年目の者です。 現在、肺の血球系細胞に注目して実験しています マウス肺を細かくしてcollagenase, DNAse処理（40分）後、 FACSでマクロファージ、DC 好酸球などsortしてRNAを抽出しようとしていますが、 どうしても好酸球と思われる分画の細胞だけRNAがきれいにとれずに困っております。 具体的にはFACSでソートした細胞をFACS Bufferでラウンドチューブに受け、遠心（300g10分）後、上澄みを捨て下をpipettingし、エッペンに移してさらに遠心（300g5分）、上澄みをぎりぎりまで捨てて残りにRLTを加え、RNA　microkit+DNA Eliminator ,細胞数によってはRNAminikit+DNAse処理でRNA抽出しています。 アレルギー刺激後で細胞数はFACS Ariaの細胞数カウントで10万個以上とれますし同時に採取したマクロファージからはそこそこの量(20ngくらい)のRNAがきれいにとれ、qPCRその他に使用できています。 Eosinophilは頑張って10万個程度採取したとしても計測不可能なほどしかRNAがとれず、qPCRをかけても18Sなどの内在性コントロールの値も異常に低値ですし、他のEosinophilマーカーといったもののqPCRがかかりません。 BioAnalyzer測定してみると好酸球分画から抽出したRNAのみ測定不能でした。　 ソートしてきた段階で細胞が死んでいるのかとも思い、ソートしてきた細胞をギムザ染色してみましたら、一部脱顆粒した細胞もいますが、一部は脱顆粒していない好酸球がみえる状態でした。 この状況で好酸球分画のみＲＮＡがうまく抽出できない理由は何か、わからず困っています。　 顆粒にはたくさんRNAseが含まれているからこれで抽出前に壊れてしまっているのでしょうか？　 御経験のある方いらしたら教えてください。 周囲には好酸球を扱っている先生はいません。。 どうかよろしくお願いいたします

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