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(無題) 削除/引用 No.2909-21 - 2014/03/29 (土) 11:29:21 - 名無し 昔のメンブレンは知らないけど、すくなくとも最近のPVDF関係の膜についてはやりすぎて膜を突き抜けるというのはよほどの事無い限り起こりにくいような気がする。膜を蛋白質染色しても染めても裏が染まる事ってないし。

(無題) 削除/引用 No.2909-20 - 2014/03/28 (金) 17:21:35 - うえ 転写バッファーには大抵メタノール入ってるから、O/Nで転写した方が、ただゲルのまま冷蔵庫とかで置いておくよりは拡散の心配はないかと思いますね。

(無題) 削除/引用 No.2909-19 - 2014/03/28 (金) 02:02:00 - おお 複数の膜に転写する方法はあるようですが、私もそれぞれの膜に同じように転写されているかどうかちょっと疑問に思います。それに、転写の効率は転写バッファー中のメタノールやSDSなどでいじれるので、そう言う工夫がある場合もあるのではと思います。 オーバーナイトのプロとコールで最近はよくやってますが、マーカーが(小さい分子をふくめ)膜の裏側のほうが表より強く見えることは今のところありません。念のために0.2umのものをつかっています。 ただ小さい分子、膜のポアサイズなどで抜けやすいものは全くないわけではないと思います。

(無題) 削除/引用 No.2909-18 - 2014/03/28 (金) 01:38:41 - ＴＳ >「ゲル1枚に対してメンブレンを2枚重ねて転写すると、 2枚目にも転写されるので1枚のゲルから2倍実験ができる」 それはない。同じようには転写されないし。 ただ、そういうのをやるキットは和光あたりから出てたような。 まぁ真っ当な人は使わないと思うけど。 >メンブレンを通り過ぎる分子もある事になるのでしょうか？ これはある。メンブレンのポアサイズによるけど、 小さい分子が抜けるのは常識。

(無題) 削除/引用 No.2909-17 - 2014/03/27 (木) 19:42:24 - AA 以前、 「ゲル1枚に対してメンブレンを2枚重ねて転写すると、 2枚目にも転写されるので1枚のゲルから2倍実験ができる」 と言っている人に会ったことがあります。 その時は、本当かな、と思ったのですが、 もしそうならあまり長時間転写し過ぎると メンブレンを通り過ぎる分子もある事になるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2909-16 - 2014/03/27 (木) 08:46:49 - 中年 拡散しやすい小さなタンパク質から早くにブロッティングされるというのは、長時間ブロッティングの長所である可能性があるということですね。気が付いていませんでしたが、なるほどその通りだと思います。

(無題) 削除/引用 No.2909-15 - 2014/03/26 (水) 22:55:33 - yyy ただ、O/Nとかで転写する際の時間経過って実際に見た人はいるのでしょうか？ 実際にはかなり早い段階で転写の大部分が終わってるとかであれば、その後に何時間かけようが結果にはそれほど影響は無いだろうと思ったのですが、どうなんでしょう？　小さい分子だと低電圧でも容易に動かせるだろうし。 大きい分子は拡散の影響はより少ないだろうし、ゆっくりじっくり変化させて動かした方が、メンブレンへの吸着も含めて、良いだろうとは直感的に思いますが。

(無題) 削除/引用 No.2909-14 - 2014/03/26 (水) 22:29:14 - 中年 実際にそれほど問題が無いというのはその通りだと思います。 私が言いたかったのは、ゆっくりブロッティングするのも、同じ時間放置しておいて後にブロッティングするのも、トータルの時間が同じならば同じことではないかと言うことです（先に書いたように、メンブレンに近い側のタンパク質から早くにメンブレンに転写されて行く、といったような事情を無視するとして）。 タンパク質分子の動きに関しては、電圧に従って泳動される項と拡散の項は独立なので、電圧を掛けていようがいまいが掛かった時間の分だけ拡散するのだと思うのですが。

(無題) 削除/引用 No.2909-13 - 2014/03/26 (水) 22:05:06 - ddd ↓ は間違えです。ちゃんと読んでいませんでした。

(無題) 削除/引用 No.2909-12 - 2014/03/26 (水) 22:03:32 - ddd BIO-RADのFastCastは1カ月保存可能だそうです。 precasting gelと同じ組成で自分で固めるタイプです。 二日しか試していませんが。

(無題) 削除/引用 No.2909-11 - 2014/03/23 (日) 02:38:26 - yyy ゲルの中でタンパクがどの程度の効率で拡散するかは条件によってかなり違うかもしれませんね。実際やってみないと確かなことは言えないかも知れません。 自分がNo.2909-3 で見た時は、室温でゴミ箱の中で紙くずとかも一緒にあってサザンとかのようにバッファーの「流れ」みたいなものがあったのかも知れない。 考えてみれば、たまにUVランプの上に放置されて干からびてるアガロースゲルにUVを試しに当てるとDNAのバンドが見えたりした経験もありますし。まあ、DNAとタンパクでは分子量がぜんぜん違いますが。

(無題) 削除/引用 No.2909-10 - 2014/03/22 (土) 14:47:07 - ああ ブロッティングバッファーに浸して4℃で保存すれば1-2日くらいは大丈夫なんじゃないかな？

(無題) 削除/引用 No.2909-9 - 2014/03/21 (金) 19:43:00 - 独り言 私は医者じゃないけど、医者さんだと当直中に実験してて、呼び出しくらったりするのかなぁ。なんて想像すると、一分も手間をかけずに保存できる方法があるかどうかってことですよね。 むしろ電気泳動を止めずに、５Vぐらいで半日ぐらい泳動続けていれば拡散もせず、流れきることもないのでは。

(無題) 削除/引用 No.2909-8 - 2014/03/21 (金) 19:36:47 - qw ＞理想的には拡散の問題からは逃れられないのではないでしょうか。 そうは思うのだけど、semi-dryで実際にオーバーナイトをやってみると、バンドが広がったり、薄くなる感触はありません。高分子量域では、転写効率が上がるのではないかとさえ思えます。まあ、サザンやノーザンのブロットを考えると、あまり拡散しないんじゃないかなと、思います。

(無題) 削除/引用 No.2909-6 - 2014/03/21 (金) 18:34:55 - 中年 タイマーを使って、通常のトランスファーをした後に放置なら（他の問題はともかく）タンパク質が拡散することはないでしょうが、低電圧で一晩掛けてトランスファーするなら、理想的には拡散の問題からは逃れられないのではないでしょうか。 もちろん、メンブレンに近い側のタンパク質から早くにメンブレンに転写されて行くので、一晩置いた後にトランスファーするよりはましなのは分かるのですが、もしゲルの厚み方向に電圧が掛かっていることで平面方向のタンパク質の拡散が阻害されるとお考えなのであれば、それは違うように思います。

(無題) 削除/引用 No.2909-5 - 2014/03/21 (金) 16:23:16 - おお 程度の違いはコンディションによって違うと思いますが、蛋白が拡散して検出感度や分解能がおちるとおもいます。すでに指摘がありますが、transferをセットして、タイマーを使って自動的に切れるようにするか、低電圧でセットしO/Nでtransferするのがいいかとおもいます。wetのタンクなら20-25Vで16hとかいうプロトコールもあります。

(無題) 削除/引用 No.2909-4 - 2014/03/21 (金) 15:02:25 - ＴＳ 低電圧のオーバーナイトで転写するか、 タイマーで転写を止めるのがいいんじゃ。 それなら、ちょっとの作業で帰れるし、次の日の時間も節約できる。 ゲルのままは拡散しそうで気持ち悪い。

(無題) 削除/引用 No.2909-3 - 2014/03/21 (金) 14:07:27 - yyy 以前に、ナンカが原因で転写しないでゴミ箱に捨てたゲルを翌朝に見たらマーカーが消えてて、やっぱり固定しないと拡散するんだ、と納得したことがありました。 ゲル板に挟まった状態では2−3時間位は問題が起きたことはありませんが、なるべく早く転写するのがベストかと。 -80Cとかだとどうなんでしょうね。やったことがある人はいそうな気もしますが

(無題) 削除/引用 No.2909-2 - 2014/03/21 (金) 12:40:20 - 名無し ガラス板から剥がさずにゲル板ごと４Cに入れとけば。4時間くらいならそうやって放置した事あるけど、結果的には特に問題なかったけど。明日ゲル見て、BPBのフロントラインが著しく拡散してるかどうかが、いけそうかどうかのひとつの判断基準になるんじゃね。つか、アクリルアミド内だと蛋白質はそうそう簡単には拡散しないわ。

ウェスタンブロッティングでのゲル保存 削除/引用 No.2909-1 - 2014/03/21 (金) 12:30:09 - ＡＹ いつもお世話になってます。 ウェスタンブロッティングで電気泳動した後メンブレンに転写すると思うのですが、電気泳動後「転写せずに」ゲルを保存しておき、翌日転写を再開する方法をご存知の方はいませんでしょうか？ 急用が入り、転写前に中断したいのですが…

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