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(無題) 削除/引用 No.2898-10 - 2014/03/24 (月) 21:27:24 - ddd 返信ありがとうございます 名無しさんのご意見は考えたことありませんでした。検討します。 おおさん 色々なシチュエーションの提示ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.2898-9 - 2014/03/24 (月) 20:14:28 - 名無し 膜蛋白質なら、ウェスタンするとき加熱処理なしでやってみれば。 強制発現だと、局在含めて果たしてどこまで本来の姿を反映してるかはちょっと分からないので内在性のものでみないことにはあれなんだが、見れないなら、例えば、膜蛋白質ということなので、ウェスタンするとき加熱処理なしでやってみる、細胞膜画分を分離してそれをウェスタンする、抗体変えるとかは。

(無題) 削除/引用 No.2898-8 - 2014/03/24 (月) 11:22:55 - おお mRNAがあるからといって蛋白ができているとはいえないし、mRNAもスプライシングあいそふぉーむが違っていたら抗体が認識しないかもしれないし、一緒でもとうさ修飾でも抗原せいが違うかもしれないし、強制発現で見れるなら検出感度を疑ってもいいかもしれないし、

(無題) 削除/引用 No.2898-7 - 2014/03/24 (月) 10:51:08 - ddd 返信ありがとうございます。 ペーペーさん 免疫染色すると核以外は染まってる感じです。 Westernは今のところFACSで検出できる細胞でも上手くいっていません。 月詠さん タンパク質分解阻害剤は考えています。カテプシンに切られそうな配列があったためカテプシンインヒビターを使ってみましたがのは効果がありませんでした。 「mRNAは強く発現している細胞なのに検出できるものとできないものがあります」と言うのは細胞腫によってと言うことです。a細胞、b細胞共にmRNAは発現していてもa細胞ではFACSで検出できますが、b細胞は検出できないという感じです。 qwさん 強制発現させるとFACSで検出できます。 alpha 容易に染まりません。

(無題) 削除/引用 No.2898-6 - 2014/03/18 (火) 18:42:47 - qw 抗体はtag抗体ではなくで、膜タンパク質の特異抗体なのですね？ 「強制発現させた場合は検出できる」とは、FACSで検出できるとの意味でしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2898-4 - 2014/03/18 (火) 18:33:30 - alpha 膜抗原なら容易に染まりませんか？ 私は頻繁にFACSで解析していますが、困ったことはありません。 むしろ、ウェスタンなんかは、膜抗原は発現が低いと難しいって聞きますね。 私はあまりウェスタンは行わないので、よくわかりませんが。

(無題) 削除/引用 No.2898-3 - 2014/03/18 (火) 16:59:41 - 月詠 強制発現した場合と同じくらい転写産物が検出されているということであれば、考えられるのは転写後のステップですね。 考えられる可能性と対応策としては、 （１）生理的な条件では、すぐに分解されてしまい不安定 　　　→ タンパク分解阻害剤で処理 （２）生理的な条件では、細胞内に局在して細胞表面にリクルートされていない 　　　→ 細胞内染色 （３）生理的な条件では、細胞表面で他の分子と複合体を形成していて、抗体が認識できない 　　　→ 異なる抗原エピトープを認識する抗体で検討 といったところでしょうか？ 「mRNAは強く発現している細胞なのに検出できるものとできないものがあります」 というのはどういう意味でしょうか？ 細胞の種類により、同じくらいmRNAが発現しているのに、検出できる細胞種とできない細胞種があるということでしょうか？ それとも同じ細胞種なのに、培養ロットごとに異なる結果になるということでしょうか？ あるいは同じ実験ロット内で、染まる細胞と染まらない細胞があるということでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2898-2 - 2014/03/17 (月) 18:20:32 - ぺーぺー さしあたって、westernや免染で発現と局在を確認するのはどうでしょうか？

膜タンパク質の検出 削除/引用 No.2898-1 - 2014/03/17 (月) 18:07:40 - ddd お世話になります。 FACSで膜タンパク質を検出しようとしていますが上手くいきません。 強制発現させた場合は検出できるので抗体はワークしていると思います。 mRNAは強く発現している細胞なのに検出できるものとできないものがあります。 どういう条件検討をすればいいのか考え中です。 よろしくお願い致します。

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