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(無題) 削除/引用 No.289-7 - 2012/03/15 (木) 17:50:13 - AP 費用に糸目をつけなければ、化学合成でも必要な精度、量を得ることは不可能ではないと思いますが。ただ、100 ntを超えるような長さとなると化学合成では難しくなってくると思います。 化学合成によるDNA合成は、一塩基伸ばすごとに数パーセントのエラー、つまりヌクレオチド付加の失敗による欠失が起こると言われています。仮にエラー率が1%で、99%は正しく反応が進むとしましょう。 一番目の塩基を伸張するとき、99%は正しい産物です。 二番目の塩基を伸長したとき、正しい産物は99% x 99% = 98% 三番目の塩基を伸長したとき、正しい産物は98% x 99% = 97% ・ ・ ・ 20番目の塩基を伸長したとき、正しい産物は82% 30番目の塩基を伸長したとき、正しい産物は74% 100番目の塩基を伸長したとき、正しい産物は36% ただのPCRをするだけなら、プライマーは長くなくていいし、多少エラーが混じっていても十分に走るので、精製はそれほど重要ではないです。 しかし、シークエンスのプライマーだと一塩基でも長さが違うと、波形がずれてしまうので、不正な産物の含有量が少ないプライマーが必要で、場合によっては鎖長で分離する精製（HPLC, PAGE)が必要です。 長い合成DNAは、全合成産物の中でエラーのない産物の割合が少なくなっているので、精度の高い鎖を精製して得ると収量が少なくなり、単価が高いものになります。

(無題) 削除/引用 No.289-6 - 2012/03/15 (木) 17:39:04 - ga 以下、参照されよ。 リン酸かオリゴとNucleaseを使った方法が、質、収量共によいssDNAが用意できます。 http://www.kenkyuu2.net/cgi-biotech2011/biotechforum.cgi?mode=view;Code=504

(無題) 削除/引用 No.289-5 - 2012/03/15 (木) 16:16:46 - Q >5-20%くらいは異なる配列のものが含まれると思います。 横道すみませんが、 どのような精製方法で、 どのような方法で、 そのような結論に至ったのでしょうか？ そこまでヒドいですかね・・・。

(無題) 削除/引用 No.289-4 - 2012/03/15 (木) 15:13:10 - take ~さん、 お答えいただきありがとうございました。 タンパク質との結合を評価したく、不純な配列のコンタミによって誤った結果を導きたくなかったので、純度は、できれば100%に限りなく近いものを求めていました。 ですが、異なる方面からの別の実験でもこれを確認することにし、この実験の配列は90-95%くらいに妥協してもよいかもしれないと考えなおしました。 Assymetryc PCRやビオチン化による精製法など、思いつきませんでしたので、大変参考になりました。また、ファージミドで合成する系も参考になりました。 これらを合わせて、もう一度計画を考えなおそうと思います。ありがとうございました。 toさん、コメントありがとうございます。 正確な数字は正しくないかもしれませんし、配列の長さや、DNA合成後の精製方法などにもよると思いますが、5-20%くらいは異なる配列のものが含まれると思います。

(無題) 削除/引用 No.289-3 - 2012/03/15 (木) 00:27:07 - to 回答でなく申し訳ありません。 少し気になったのでお教えいただけますと幸いです。 >メーカーのプライマーや遺伝子合成などで作製したものを直接使用するのは、どうしても配列の異なるものが多く含まれてしまう これは、どのくらいの割合で配列の異なるものが含まれているのでしょうか？それほど精度が求められる実験はしていなかったこともあり、気にした事が無かったのですが、「多く含まれてしまう」と言うのを読んで気になってしまいました。

(無題) 削除/引用 No.289-2 - 2012/03/14 (水) 16:13:03 - ~ 外注出して、PAGE精製をかけるのではグレードが足りないということですよね。 具体的にはどのくらいのグレードを求めているのでしょうか？ 先にグレードを決めておかないと、精製はコストがいくらでも増加しますよ。 Asymmetric PCRではグレードが足りませんか？ または、 いらないほうのストランドのプライマーをビオチン化してPCRし、 ストレプトアビジンビーズに付けて洗った後、 解離させてビオチン化されていないほうの一本鎖DNAを溶出し、 その後好みの精製をかける はいかがでしょうか。 最近、ビオチン化プライマーを使用した一本鎖DNAの取得について、こちらの掲示板でトピックに上がっていましたよね。 どの位配列に制限を受けるのかやグレードが分かりませんが、ファージミドで合成する系もありますよね。

均一な一本鎖DNAの作製方法 削除/引用 No.289-1 - 2012/03/14 (水) 14:58:00 - take こんにちは。 いつも勉強させていただいています。 異なる配列の混ざりこみが少ない一本鎖DNAの作製方法についてお伺いしたいのですが。 長さは50-500bpくらいを考えています。 メーカーのプライマーや遺伝子合成などで作製したものを直接使用するのは、どうしても配列の異なるものが多く含まれてしまうので避けたいです。 いったんプラスミド合成をしてそこから片方の鎖だけをとってくるのがいいのでしょうか？それは可能なのでしょうか。 もしくは他に有効な方法があれば教えていただけると幸いです。 どうぞよろしくお願いします。

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