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(無題) 削除/引用 No.2886-17 - 2014/03/14 (金) 15:14:37 - とり PCRさん わざわざありがとうございます。 スッパリ否定されていたので、何か自分が勘違いしているのかと思いました。

(無題) 削除/引用 No.2886-15 - 2014/03/14 (金) 09:38:23 - PCR とりさん 既に間違いだらけの書き込みをしていて穴があったら入りたい気持ちなのですが、ここは出てこないといけないですね。 >今回はAとBは互いに影響し、またAもBもpromotor Xの発現に影響するという条件なので、AとBが両方入った細胞以外はノイズになり、しかもAとBは逆の作用があることから結果を相殺すると思ったのですが。何か間違えていれば教えて下さい。 全く間違っていないと思います。Aだけが入った細胞、Bだけが入った細胞、どっちも入ってない細胞、それぞれノイズになりますね。私もそう理解しました。 で、ここからが私のアホなところですが、なぜかAとBが1:1で働くことを想定して(言い訳:先に書いた後輩の実験の例がそうだった)、Aのみが発現する細胞とBのみが発現する細胞の数は大雑把にいって等しくなって活性の上げ下げ作用がプラマイゼロになるから(これが、細胞が多いと「結果が平均化されるので無視でできる」の意味。細胞の数が少ないと、Aだけ発現細胞がBだけ発現細胞に比べて多いとか少ないとか偏ることがあるけど)、そこは無視しても良いんじゃないかなあ?と書いたわけです。完全に私の間違いです。重ね重ね、皆様を混乱させて申し訳ありません。

(無題) 削除/引用 No.2886-14 - 2014/03/14 (金) 07:51:41 - とり PCRさん RenillaとFire-flyのluciferaseは、それぞれの発現に影響しないのでwellで平均化して問題ないですが、今回はAとBは互いに影響し、またAもBもpromotor Xの発現に影響するという条件なので、AとBが両方入った細胞以外はノイズになり、しかもAとBは逆の作用があることから結果を相殺すると思ったのですが。何か間違えていれば教えて下さい。あと、細胞が多いと「結果が平均化されるので無視でできる」の意味はどういうことでしょうか？後学のために教えていただけるとありがたいです。 monさんの提案された量比を変えるのが、現状できる一番簡単な方法だと思いました。 AとBが1:1で作用しているのでなければ、適切な割合を見つけるのは必要だと思います。

(無題) 削除/引用 No.2886-13 - 2014/03/14 (金) 05:47:38 - PCR たびたびすいません。私は、入れるDNA二種を区別するためにアルファベット順でA、B、書いたのですが、ルシフェラーゼさんの説明のA、B、とは活性の上り、下がりが逆ですね。また、ルシフェラーゼさんの実験系だと、Bによる活性の低下は、非常に少量で見られるとのこと。どうも、わたしの書いたアドバイスはルシフェラーゼさんの実験系では適用されないように思います。忘れてください。混乱させてしまって申し訳ありません。

(無題) 削除/引用 No.2886-12 - 2014/03/14 (金) 02:09:40 - PCR Aを先に入れてしまうと、Aの方が(後から入れたBに比べて)効率よくトランスフェクションされる可能性があるので(逆もあるかもしれませんが、それは私にはわかりません)、その可能性を潰しておこうということです。 特に、規定よりも多めの発現ベクターを入れていたのであれば、まずAを入れる>トランスフェクション試薬がAで飽和、あるいはそれに近い状態になる>後から入れたBの為に使われるトランスフェクション試薬がマスターミックス液内に残っていない という状態にならないとも限りません。故に、同時に入れることを提案しています。 もちろん、上の話にはいくらでも反論できる余地がある(そんなすぐに飽和したりしないだろう、とか)ので、かならずしも私の言っていることが正しいかはわかりません。先に書いた通り、昔の同僚にはそんなん関係無いと言われてますし。ただ、それでうまくいった例もありましたよ、という話です。

(無題) 削除/引用 No.2886-10 - 2014/03/14 (金) 01:17:10 - ルシフェラーゼ PCRさん AとBのミックス液を作っておくとのことですが、別々に入れるのと何が違うのでしょうか？ ミックス液を作るよりむしろAを入れて、Bを入れて....の方が間違いなくAとBの量を取らんスフェクション液に加えることが出来ると思いますが。 ミックス液を作る理由は何なのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2886-9 - 2014/03/14 (金) 01:04:40 - PCR 書き方が悪かったようで、きちんと伝わってないように思うので確認させてください。 >マスターミックスを作成して各チューブに移した後、AとBの発現ベクターを入れて実験しています。 この、"AとBの発現ベクターを入れて"のところで、AとBを入れる順番がいつも一定だったりしていませんか?というのが私の先の書き込みの趣旨です。すなわち、マスターミックスの入った各チューブに発現ベクターを入れる際、まずAをx ul 入れて、次にB を y ul 入れて、とやっていませんでしたか?ということです。 そうやって順番に入れるのではなく、AとBは完全に同時に入れるようにしてみて下さい。その為に、AとBを混ぜたDNAミックス液を作っておいて、そのDNAミックス液からマスターミックスの入った各チューブに発現ベクターを入れるようにしてみて下さい。 DNAミックス液を作る際にAとBの比率を変えれば、濃度依存性も見れます。

(無題) 削除/引用 No.2886-8 - 2014/03/14 (金) 00:40:40 - ルシフェラーゼ momさん 現在の実験において500ngが推奨量ですが、約3倍の量を入れていました。 もしかしたらと思ってはいましたがやはり素直に容量を守って実験した方が良さそうですね。 PCRさん トランスフェクションの方法としては必要ウェル数+αのopti-memにX-firefly Luc(200ng x必要ウェル+α)とpGL4.74[hRluc/TK](10ng x必要ウェル+α)を混ぜたマスターミックスを作成して各チューブに移した後、AとBの発現ベクターを入れて実験しています。 出来る限り共通のものは同じ操作をしているのでこの点に関しては問題ないかと思います。 ただ、今思ったのですが、レニラのベクターを非常に少ない量しか入れていません。 すなわち細胞にトランスフェクションしたとき、細胞に入る量が非常に少ない？ため正しく補正できているのか？と少し疑問に思いました。 本当に基本的な質問なのですが、fireflyとrenillaのベクターはそれぞれどのような比率、もしくは量を入れるのが良いのでしょうか？ あと、チューブへの吸着についてですが、Bを発現するベクターはF-lucの活性が約50%ほど低下する量を事前に検討した結果、1wellあたり10ngもしくは30ngと非常に少量です。 ただ、マスターミックスを作った後、それぞれのチューブにBを入れているので問題ないようにも感じますがDNAが吸着している可能性というのも考えないといけないなと気づかされました。 ありがとうございます。 あと、AとBはそれぞれ容量依存的にLucの活性を変化させることを確認しています。 その他、考えられる問題点等ありましたらコメントいただけると幸いです。

(無題) 削除/引用 No.2886-7 - 2014/03/13 (木) 23:49:10 - PCR AとBを入れる順番を常に一定にしていたりしませんか? 昔、同じような実験で結果が出ないと困っていた後輩に、実験に使うプラスミド(monさんが仰るようにC(うちではAとBのバックボーンベクターのpcDNA3.1)も含めて)は最初別のチューブにミックスを作って、そこからトランスフェクション試薬に入れるように言ってみたところうまくいったことがあります。monさんが言われるような濃度勾配のデータも綺麗に取れました。 チューブへの吸着を考えて、結構多めの量でミックスを作ると良いと思います。 まあ、別の同僚はそんなん関係ないとも言ってましたが、うまくいった例があるということで。 とりさんの仰る話は、理論的には確かにそうなのですが、細胞を10の4乗とか使うと結果が平均化されるので差が無視できるようになるのではないかなあ? Dual-Luciferase計測キットのプロトコロールなんかを読んでみると良いと思います。

(無題) 削除/引用 No.2886-5 - 2014/03/13 (木) 20:16:11 - mon >[Re:4] ルシフェラーゼさんは書きました : > トランスフェクション試薬のデータシートに推奨の総DNA量が記載されていますが、例えばそれが1ugだったとして、1ugよりも多い総DNA量をトランスフェクションすると、具体的には2ug,3ugの量を使用するとmomさんの仰る実験が上手く行かなくなった経験等おありでしょうか？ 上手くいかないのは普通な事です。DNAとトラスフェクション試薬の細胞毎に最適比があります。その比率でDNAを増やすとトラスフェクション試薬量も増えますが、毒性が顕著に増加するでしょう。 推奨量が1ugならそれを守るべきです。その中で各plasmid量を調整します。 複数のplasmidを混合する場合は、その品質が重要です。endotoxinを除去した方が結果が安定する場合もあります。

(無題) 削除/引用 No.2886-4 - 2014/03/13 (木) 18:25:10 - ルシフェラーゼ とりさん、momさん、お返事ありがとうございます。 とりさん 薬剤耐性でセレクションをかけるのは良い方法だと思いました。 是非、検討させていただきます。 momさん その実験を現在やっているのですが上手く行きません。 トランスフェクション試薬のデータシートに推奨の総DNA量が記載されていますが、例えばそれが1ugだったとして、1ugよりも多い総DNA量をトランスフェクションすると、具体的には2ug,3ugの量を使用するとmomさんの仰る実験が上手く行かなくなった経験等おありでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2886-3 - 2014/03/13 (木) 12:19:09 - mon 一過性発現でのアッセイですよね。 通常は、AもBも発現しないplasmid Cを用意して、総plasmid量を一定にしてA+C,B+C,A+B, Cのみを比較します。 また量依存的な効果が示せればより信頼性が増すので、 A100%, A75%B25%, A50%B50%, A25%B75%, B100%の比較や、A100, A75B25, A50B25C25, A25B25C50, A10B25C65, B25C75なども行ってみると良いかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.2886-2 - 2014/03/12 (水) 18:17:22 - とり 導入効率は細胞によりますが、100%というのはまずありません。 co-transfectionするプラスミドが増えると、その分全てのプラスミドが入った細胞の割合は少なくなるわけで、Aだけ入った細胞とBだけ入った細胞と両方入った細胞が共存することを考えると差があまり見えないでしょうね。 そのため、両方入った細胞だけを選択的できればよいわけですが、すぐ思いつくのは、 1. AとBを一つのプラスミドに入れる 2. AとBのプラスミドに異なる薬物耐性を入れる でしょうか。 1は、IRESや2Aペプチドを使えばよいですが、前後逆のパターンも作って、両方同等な結果が得られることを示さないといけないでしょう。 2では、比較的効きが早い薬物(Puro、Hygroなど）を入れた発現ベクターを導入し、次の日に両方の薬物を入れた培地でセレクションをかけて、1-2日後にアッセイすればよいはずです。AのみまたはBのみを発現させるために、空ベクターをco-transfectionして比較します。 上手くいくかはわからないのですが、とりあえず。

ルックアッセイでトランスフェクションするプラスミド量 削除/引用 No.2886-1 - 2014/03/12 (水) 17:55:12 - ルシフェラーゼ プロモーター（X）によってルシフェラーゼを発現するコンストラクトを使用して実験しています。 あるタンパクAをコードする遺伝子をco-transfectionすることによってXの活性が上がるもの、 逆にタンパクBをコードする遺伝子をco-transfectionすることによってXの活性が下がることがわかっています。 またAがBの機能を抑えることがわかっています。 そこで Bによって低下したlucが、 AとBをco-transfectionすることで元に戻るような実験をしたいのですが、どうも上手く行きません。 Bによる活性低下がAを入れることによって若干回復するのですが、本当に若干であるため困っております。 こういった実験に詳しい方、ご教授よろしくお願いいたします。

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