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pTNtOgokwVCQHAoBfPK 削除/引用 No.2877-12 - 2017/10/22 (日) 05:51:51 - JimmiNi EejMCM http://www.FyLitCl7Pf7ojQdDUOLQOuaxTXbj5iNG.com

(無題) 削除/引用 No.2877-11 - 2014/03/11 (火) 06:47:16 - KY 誤字がいっぱいありましたね。すみません。 PlatE, 293T+EcoPackともにMEFだとGFPで70-80％以上は（NIHと同程度）入ると思います。 トランスフェクションは For Plat E Fugene 6（プロメガ）30　micro l plasmid DNA 10 micro gram For 293T Plasmid DNA 5 micro g EcoPack 5 micro g Fugne 6 30 micro l といった感じです。 なお293Tは293FTというものを今のラボでは使っていて、あまり気を付けてcultureしなくてもタイターには問題ありません。 ただ元ラボで293Tを使った時は、全然入らなかったことがあるので、もしかすると293Tのsublineによっても入りやすい、入りにくいがあるのかもしれません。 以前Plat-Eを開発された北村俊雄先生のお話をお聞きした時に、293Tにgag, pol, envを入れてドラッグセレクションした後に、ウィルス産生効率の高いものをピックアップしてPlat-Eを樹立したとかいう話をされていたのを思い出します。 お使いの293Tがいまいちであれば、うまくいっているラボの293Tを入手されてみるのがよいのではないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2877-10 - 2014/03/11 (火) 06:30:31 - KY VSVGはもしかすると、細胞毒性があるかもしれません。 PlatE（envも入っていて、MMLVのenvだった気がします）だと、タイたーチェックしなくてもMEFに70-80％結構入ったと思います。 あとPlatE（Phoenixもそうかもしれません）は飼い方がちょっとむずかしくて、一度コンフルエントにすると産生するウィルスのタイターが格段に落ちると思います。 また293Tをお持ちで、EcoPack（パッケージングコンストラクトのプラスミドDNA）をお持ちなら、割とタイター安定していると思います（以下の論文のサプリメント参照。かなり丁寧にプロトコールつけてくれています）。これもGFP70-80％ もしどうしても入らないようでしたら、ファイブネクチンコート（レトロネクチンと同等です）したplateで、spinfectionされてはどうでしょうか？ （これも以下の論文のサプリメント参照） Nature Methods 3, 287 - 293 (2006) http://www.nature.com/nmeth/journal/v3/n4/pdf/nmeth865.pdf

(無題) 削除/引用 No.2877-9 - 2014/03/11 (火) 05:46:06 - U まず、3T3でtiterを測定。で、そのtiterに基づき、MOI=10-100でMEFに感染。もし、titerが低ければ、PEGで濃縮。3T3でtiter測定不能（GFP陽性細胞が検出できない）ならば、packagingの問題なのでPhoenixのgag-pol発現及びpCMV-VSVG plasmidのsequenceの確認。といった感じでしょうかね。3T3で感染するならば、ライン化されたMEFには感染するはず（3T3は不死化したMEFなので）。 一応Phoenixへのlipofectionで70%GFP陽性という事なので、GFP-Cre plasmidは問題ないものと考えますが、もしGFP陽性率を蛍光顕微鏡下で判断しているのであれば、顕微鏡のsettingも気になります。FACSであれば間違いないでしょう。 pMXとVSVGの組み合わせですが、個人的には、3T3でのtiter測定レベルでトラブルになった事はありません。もう少しVSVGの量を多めでやってましたが、本質的な問題ではないでしょう。通常293Tのtri-transfectionでやっているので、Phoenix-GPというpackaging lineを使った事がないのですが、入っているgag-polはretrovirus用ですよね？

(無題) 削除/引用 No.2877-8 - 2014/03/11 (火) 04:09:46 - MEF Harmonia様、通りすがり 様 お返事本当にありがとうございます。 Phoenix GPは293T細胞がワークしなかったので、最近（1ヶ月以内）に購入したものです。また、通りすがり様のご指摘通り、GFP陽性細胞は少ないけれども存在しているので、ウイルスはわずかに産生されていると考えています。 濃縮方法は、VSV-Gを使用していることから、12000gで20時間程度遠心することで50倍程度に濃縮しています。ウイルス粒子が壊れていることはないと思いますが、PEG濃縮も検討してみます。

(無題) 削除/引用 No.2877-7 - 2014/03/10 (月) 23:58:23 - 通りすがり 多核でも感染している細胞があるなら、 力技だし、ウイルスの出来具合的にもちょっと気持ちわるいけど濃縮でなんとかなりそうな気もするけど、、、、 濃縮方法は限外濾過ですか？ もし限外濾過だったら、PEGで濃縮する方がいいかもしれない。 やすいしね。すでにやっていたらすみません。

(無題) 削除/引用 No.2877-6 - 2014/03/10 (月) 08:26:40 - Harmonia おてもとのPhoenix GP細胞が、まちがいなくPhoenix GP細胞であることは どのように検証できますか？ また、「gag polを安定発現」の検証は？ 買い直した方が良いのかも？

(無題) 削除/引用 No.2877-5 - 2014/03/09 (日) 05:15:59 - MEF ~様 お返事ありがとうございます。 他の細胞ではまだ試していませんでした。仰る通り、他の細胞(3T3、293T)で試してみる必要がありますので、結果がで次第追記します。 ただ、phoenix(293T由来)をウイルス回収後、更に24時間培養したことがありますが、追加のGFP発現はほとんど見られませんでした。アデノウイルスを293で増幅していたときは、トランスフェクション効率が悪くても最終的には100%の細胞がGFPポジティブとなったのですが。Titerの違いでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2877-4 - 2014/03/08 (土) 15:55:54 - ~ ウイルス液をMEF以外の適当な細胞にかけた場合、GFPは発現するのでしょうか？ ウイルスができていないのと、ウイルスはできているけどMEFに入らないのとでは、 取るべき対応が変わってきますよね。

(無題) 削除/引用 No.2877-3 - 2014/03/08 (土) 10:52:43 - MEF MP様 お返事ありがとうございます。 293Tですが、実はPhoenixGPを使う前に試したのですが、これも全く良い結果が得られませんでした。ただ、うちの293Tのトランスフェクション効率が悪いのも原因だったかもしれませんが。。 あと気になることがもう一つあるのですが、gfpの発現が確認できるMEFが数個存在していたのですが、それらが全て多核なのです。感染効率が悪いことと関係があるでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2877-2 - 2014/03/08 (土) 08:48:07 - MP gag-polもtransientで293Tにいれるのはどうでしょう？ でもプラスミドがないと、すぐにはできないか、、、。

初代MEFへのレトロウイルス感染 削除/引用 No.2877-1 - 2014/03/08 (土) 08:34:18 - MEF 皆様、どうか御知恵を拝借させてください。よろしくお願い致します。 現在、flox/floxマウス由来Primary MEFにGFP融合Creを発現するレトロウイルスを感染させて、ノックアウトMEFの作製を試みておりますが、うまくいかず困っております。 パッケージング細胞はPhoenix GP (gag polを安定発現)、envはpCMV-VSV-Gを、pMXs-GFP-Creと共にLipofectamine2000で導入発現させています。導入効率は70％前後と悪くないのですが、培養上清を濃縮しても、MEF細胞への感染（GFPの発現）はほとんど見られません。line化されたMEFもPrimary MEFも同様の結果でした。 プラスミドの量比はenv:pMXs=1:2で行っていますが問題はありますでしょうか。以前PlatE細胞を使っていたときは全く問題はなかったのですが、Phoenix GP細胞とpMXs、VSVGの組み合わせが悪いということはあるのでしょうか。PlatE細胞の使用も検討しているのですが、出来れば今ある材料で問題解決できれば、と考えております。 ささいなことでも結構ですので、どうかよろしくお願いいたします。

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