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(無題) 削除/引用 No.2874-11 - 2014/03/10 (月) 23:45:11 - 通りすがり あー、浮遊細胞なのか。 それならふろさんの言う通り、flowcytoがいいね。 ただ、PI染色と違って抗体染色だと、washの過程でlossが大きいから、 最初の細胞数を多くしないと、いくらflowがratioで出してくれるって言っても 安定しない結果になるから注意してね。 flowcytoやってるラボなら釈迦に説法かもしれないが、、、、 あと、少し気になったのが、細胞を培地ごとwellに移してはりつける、ってパタンだと、 リンパ系の細胞だと産生したIgGとかがwellにくっついてノンスペになりそうな気が、、、、 抗BrdU抗体ってマウスモノクロが結構でてるので。 まぁ、浮遊系ほとんどやった事無いし、免疫細胞は扱った事無いので、 的外れかもしれないけど。

(無題) 削除/引用 No.2874-10 - 2014/03/10 (月) 11:55:43 - ふろ あともう一点。 BrdUなしのコントロールで吸光度が高いのは、抗体反応後の洗いが不十分だからでしょう。 壁面に少しでも残っていると反応して色がつきます。 普通のELISAなら、ブンブンふった後にキムタオルにガンガン叩き付けて水切りしますが、細胞が居る場合は多めのバッファーをいれてピペットで吸ったほうが上手くいく印象です。 いずれにしても、フローサイトをお勧めします。

(無題) 削除/引用 No.2874-9 - 2014/03/10 (月) 11:50:57 - ふろ 浮遊細胞ですね。 その場合、洗ったりしている段階で剥がれてしまう可能性は高いでしょうね。 ELISA法の利点は簡単に多数のサンプルを測定できることですが、細胞数が揃っていることが前提となるので、細胞数がばらついてしまうとわけのわからない結果になります。 乾燥させるステップは接着系の細胞では不要ですが、浮遊細胞の場合はプレートに吸着させる目的があるのだと思います。もしくは、PLLなどをコートしたプレートで強制的に細胞を接着させる方法もあります。 ただ、いずれの場合も細胞数で吸光度をノーマライズしないと正確な値はでません。 フローサイトが可能な環境であれば、BrdU標識した細胞をフローで見た方が良いと思います。 そういうキットもあるので、そのプロトコールを参考にすればよいと思います。 BrdU抗体にHRPがついていても、その抗体に対する蛍光標識抗体を用いればフローは可能でしょう。 あとは、予算に余裕が有ればEdUを使った方がいろいろ楽かもしれません。

実験をもう一度行ったのですが・・・ 削除/引用 No.2874-8 - 2014/03/10 (月) 10:16:12 - syosinnsya.kenkyuuin みなさん、アドバイスありがとうございます！！ 意見を参考に、もう一度実験を行ってみました。 私の使う細胞は浮遊細胞です。 大まかなプロトコールは、、、 �@細胞をまいて培養する �A刺激物質を加えて培養する（２種類の細胞で、この刺激物質に対する反応生をみたいです。予想としては、一方の細胞は、刺激物質を加えることで、細胞周期のS期の割合が著しく増加するため〜フローで確認済み〜、BrdUアッセイにも違いがあるのでは、とみています。） �BBrdU試薬を加えて培養 �C遠心して培地取り除く �DFix solution（固定と変性）加えて培養 �Esolutionアスピレートし、wash３回（この間は遠心なし。プレートをひっくり返してキムタオルの上でトントンする） �Fanti BrdU抗体加える（RT１時間） �Gwash（�Eと同様に） �Hペルオキシダーセ抗体を加える（RT３０分） �Iwash（�Eと同様に） �Jペルオキシダーゼ基質TMBを加える（RT３０分） �Kstop solution加え、プレートリーダーで測定 という感じです。 コントロールとして、 細胞なし（培地のみ）、細胞ありでBrdU試薬加えない（かわりに培地加える） それぞれ刺激物質ありとなしの両方用意しています。 今回の結果では、刺激物質ありのBrdU入れないコントロールが、（BrdU試薬入れてないはずなのに）値が高かったり、刺激物質ありなしの両方で、細胞なしのコントロールの値が高かったりと、理解に苦しむ結果になりました。 実験方法の段階から検討する必要があるのかと思い、ここに記載させて頂きました。 何か意見やアドバイスなどありましたら、何でも良いので、メッセージを頂きたいです。 どうかよろしくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.2874-7 - 2014/03/06 (木) 17:07:01 - 通りすがり あー、やっぱりそうか。 それなら、固定＆変性、wash、抗体反応、wash、発色ってかんじかな。 普通のELISAと同じような感じでしっかり残液をきってやって（ちゃんとやりたいなら遠心機つかうとか）、特に乾燥させる必要は無いんじゃないかと思うけど。 乾燥させる方が抗体がアクセスしやすいのかな？酸処理で十分だと思うけどなぁ。 まぁ、細胞がへばりついていて、その後のステップで核（のなかのDNAにとりこまれたBrdU）がながれなければおkだと思うから、 乾燥させても大丈夫な気もするけど、自分でやるならあんまり乾燥はさせたくないなぁ、、、、 うーん、酵素での定量はやったことないし、プロトコルが分かってないから てきとーなことしかいえないなぁ、、、

(無題) 削除/引用 No.2874-6 - 2014/03/06 (木) 16:49:07 - syosinnsya.kenkyuuin みなさんアドバイスありがとうございます！！ 説明不足で申し訳ありません。 ９６穴プレートで、HRP発色させて、プレートリーダーで吸光度の測定を行います。

(無題) 削除/引用 No.2874-5 - 2014/03/06 (木) 15:53:19 - 通りすがり あー、96穴とかで、HRPで発色させて、吸光度で定量するのかな？ それなら、残存液で濃度がへんかするかもしれないから、乾燥させる方がいいのかもね。細胞がへばりついてさえいれば、どうなっていてもかまわないだろうし。

(無題) 削除/引用 No.2874-4 - 2014/03/06 (木) 15:48:56 - 通りすがり どういう解析をしたいのかがよくわからない。 ICCならやったことあり、よっしーさんと同様だけど、 >アスピレートしてからキムタオルで逆さまにたたいて水分を除く ってあるからflowcytoをやりたいの？ それでも乾燥なんか絶対やらないと思うけど。 もっと詳しく書いたら？

(無題) 削除/引用 No.2874-3 - 2014/03/06 (木) 14:07:20 - よっしー 固定後塩酸処理をした後の操作でしょうか？ 私は塩酸をアスペートした後すぐにpH10くらいのホウ酸で中和していました． 数分後にホウ酸をアスピレートし，念のために再度ホウ酸でインキュベートしてから，PBSで洗ったのちに染色していました． 私は乾燥するとバックが上がるので，すべての操作で決して乾燥させない様にしていました．

(無題) 削除/引用 No.2874-2 - 2014/03/06 (木) 12:49:11 - gogo 培養細胞のBrdUはしたことないからわからんけど fix後はfix液（塩酸？）を完全ではないが液を取り除き、そのままＰＢＳなどを入れて、細胞を2回ほどwashすればよいだけだと思います。

BrdUアッセイのFix solutionの除去について 削除/引用 No.2874-1 - 2014/03/06 (木) 12:33:58 - syosinnsya.kenkyuuin こんにちは。 実験初心者のものです。 現在BrdUアッセイを行っています。 条件を検討中の段階なのですが、疑問なことがあり、質問させていただきました。 初歩的なことだ思うのですが、よろしければアドバイスをお願いいたします。 BrdUの取り込みは３０分にして、その後培地をアスピレートし、BrdUの残存をなくすため、培地でwashしています。それからFix solutionで固定と変性を行う（30分インキュベート）のですが、その後のsolutionの取り除き方に迷っています。 プロトコールにはFix solutionを完全に取り除き、乾燥させると記載があったのですが、アスピレートしてからキムタオルで逆さまにたたいて水分を除くと、細胞までいなくなってしまうように思えます。 調べた文献では、ドライヤーや乾燥機を使用しているところもあるようですが、あまり不必要な刺激を与えたくありません。 何かこの作業でこうしたら良いなどのアドバイスがありましたら、ぜひ教えて頂きたいです。 よろしくお願いいたします。

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