いつも勉強させていただいています。
マウスの褐色脂肪組織をHE染色していますが、上手くいくと教科書にあるように、個々の細胞境界を同定でき、細胞内に細かく仕切られた脂肪滴の存在が見られます。ただ、しばしばうまくいかず、細胞内の脂肪滴が風船のようにな空包になり、顕微鏡で観察した印象では、まるで蜂の巣のようになってしまいます。隣り合う細胞境界が崩壊して、大きな風船になっているところもあります。
プロトコールですが、マウスを4%PFA/PBSで灌流固定し、褐色脂肪組織を取り出して4%PFA/PBSで1日後固定、メタノール：クロロホルム3時間、エタノールの脱水系列で脱水、続いて透徹、バラフィン浸透、包埋、ミクロトームで薄切。
メタノール：クロロホルムによる脱脂ステップ以外は他の組織（脳、肝臓、腎臓）と同様に行っています。他の組織で同じような問題が生じたことはありません。
脱脂の効果は明瞭で、組織の色も変わりますし、脱脂後は褐色脂肪組織が溶液に沈むようになります。メタノール：クロロホルムは新鮮なものを使用するようにしています。
以上のようなプロトコールで同じように行っているつもりなのですが、上手くいくときは同時に扱っているどの褐色脂肪組織も良好な形態を保持しているのに、ダメなときは、同時に扱っているどの褐色脂肪組織も蜂の巣のようになってしまいます。
自分で気づかないうちに一定でない部分があり、そのために大きな結果の違いになっているのですが、どの部分がダメなのかがわかりません。
大小の風船からなる蜂の巣のようになってしまう原因として考えられるものをご教示いただけないでしょうか。よろしくお願いいたします。 |
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