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(無題) 削除/引用 No.2860-3 - 2014/03/03 (月) 00:01:17 - ロボコン やはり一次抗体の標識ですかね。元々のシグナルは弱いので少し心配ですが試してみようと思っています。自家蛍光でない事は確認しております。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.2860-2 - 2014/03/01 (土) 23:39:38 - 名無し もし原因が2次抗体らしいなら、1次抗体を蛍光かHRPで直接標識して、２次抗体なしで検出すればどうよ。２次抗体を使わないので感度はやや下がるけど。 標識用のキットは市販されてるよ。 あと自家蛍光の可能性はないか。ていうのが、うちら的には、凍結切片だと（パラフィン切片のときよりも）変な自家蛍光が出やすい気が普段からしてるんだが。骨格筋はやったことないのでわかんないけど。もしそうなら、抗体をいじっても問題は解決しないなあ。もちろん自家蛍光って判明すれば、論文には『このシグナルは自家蛍光なので関係ありません』って記載すればそれでいいんだが。 抗体ないしでやってみたときはどんな感じかなあ。

下肢骨格筋のmouse on mouseを用いた免疫染色 削除/引用 No.2860-1 - 2014/03/01 (土) 08:06:16 - ロボコン 血管内皮細胞に特異的にflag tagのついたfusion proteinを発現するTg miceを用いた実験を行っております。蛍光二重染色にてflagのついてfusion proteinが血管内皮に局在することを確認したいと考えています。骨格筋の研究をしているためできれば骨格筋内の血管においてこれを証明したいと考えております。骨格筋の凍結切片を用いて免疫染色を行っておりますが、3種類ほどanti flag antibodyを試したところ(Sigma F1804, Cell signaling 2368, Cosmo Bio KAL-KO602-S )、あるCosmo Bio KAL-KO602-Sで血管内皮にシグナルが認められました。しかしこの抗体はmouse monoclonal antibodyであり，VectorのMOM kit を使って免疫染色を行っておりますが、筋細胞膜に非特異的な染色が認められてしまいます(コントロールのmouse IgGでも筋細胞膜に染色あり)。バックグラウンドを下げる良い方法がありましたらご教授いただけないでしょうか？またmouse以外の動物種で作られたよいAnti-flag antibodyがありましたらこちらも教えていただけないでしょうか？ 染色の方法は冷アセトンで20分固定後、kitのプロトコールに従い染色しています。2次抗体はalexa 594 1:000で1時間行っております。

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