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(無題) 削除/引用 No.2852-9 - 2014/02/26 (水) 23:04:37 - トト 7744様 重ねての情報をありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2852-8 - 2014/02/26 (水) 10:58:03 - 7744 間違えました、水は1.7 uLです。

(無題) 削除/引用 No.2852-7 - 2014/02/26 (水) 10:56:44 - 7744 私はPCRの条件を変えるのを嫌って、余りますが25 uLでPCRします。 その後PCRプロダクト5 uLを用いて泳動を行います。 ExoSAP-ITでの処理は以下のように調製しています。（１個分） 水を1.5 uL PCRに用いたx10バッファーを0.2 uL（最終濃度はPCRの時と同じに）（x5 bufferなら0.4 uL） ExoSAP-ITを0.1 uL 上記を2 uLずつ分注 PCRプロダクトを5 uL 反応は37C,15分、80C,15分です。（マニュアル通り） シーケンス反応は0.6 uLのBigDyeを用いて、10 uLの反応系で行っています。 サンプルは上記のExoSAP-ITで処理したものを1 uL これで今までは問題なかったです。 もしシーケンスの反応でbigdyeをケチっているプロトコールなら、PCRプロダクトは希釈した方がきれいに読めるかもしれない。 個人的に感じているのは、PCRのサイクル数で読みたいDNAの量を調節するのはなかなか不安定なので、PCRではプラトーに達するように反応させ、ExoSAP-ITで処理する時にPCRプロダクトを希釈して調節しています。私はいつも10倍してからExoSAP-ITで処理しています。

(無題) 削除/引用 No.2852-6 - 2014/02/26 (水) 10:36:16 - TY 一部，文字化けしてしまいました．PCRの1反応あたり，ExoSAP-ITの原液が0.2 uLずつです．

(無題) 削除/引用 No.2852-5 - 2014/02/26 (水) 10:34:07 - TY 10 uLでPCRして2 uLを泳動に使い，残りにExoSap-ITを0.2 µL/反応となるようにしてます（水で希釈して5 uLずつ加えています）．反応時間は37C, 80Cともにオリジナルの2倍程度に長めにしていますが，必要かどうかは検討していません．ラベリングには1 uLを使用しています（10 uLの系）．PCRとラベリングのプライマは共通です（20 mer）．

(無題) 削除/引用 No.2852-4 - 2014/02/26 (水) 09:48:13 - トト もうひとつ教えてください。 泳動してカラム精製をする場合には収量が悪いので、PCR反応を50ulで実施しています。ただ精製の目的はシーケンスだけなので、もったいないと感じています。 収量が良いらしい、Exosapの場合は、泳動してシングルバンドであるかを確認するための10ulと、Exosap処理してシーケンスするためのもうちょっとで出来ないかと考えています。 Exosapを使われている皆様は、どのくらいのスケールでPCRを実施されていて、どのくらいの液量をシーケンスに用いられているのでしょうか？たとえば、20ulでPCRをして、10ulを泳動してエチブロ染色をして、明瞭な（orうっすら見える程度）バンドが見られたら、残りの10ulにExoを0.5ulと、Sapを0.5ul入れて反応して、反応液の2ulをシーケンスに用いるといったような日頃、お使いのパターンを教えていただけると有り難いです。

(無題) 削除/引用 No.2852-3 - 2014/02/26 (水) 09:40:00 - トト 7744様 御意見をありがとうございます。ダイマーを気にせずに使ってみようと思っています。 なおNEBのExoとSapを組み合わせて購入しようと考えています。

(無題) 削除/引用 No.2852-2 - 2014/02/25 (火) 18:40:29 - 7744 私は最近よくExoSAPでダイレクトシーケンスをするようになりました。 詳しい人からは違うと言われるかもしれませんが、私はプライマーダイマーは気にしたことがありません。 プライマーは、PCR用とシーケンス用共通で、40bp以上のものを使用しています。 もちろん予測ソフトで予測を行いますが、目的はTm値を知るためぐらいで、プライマーダイマーを気にしていたら目的のプライマーが作れないことがあるのでほぼ無視して作っています。 そんないい加減な感じでも、今までやった６〜７種類のダイレクトシーケンスで読めなかったことはありません。 ちなみに、何を使いますか？ 私はAffymetrix/USB社のExoSAP-ITを使っていますが、かなりケチれますよ。

Exosapでダイレクトシーケンスの際にダイマーは？ 削除/引用 No.2852-1 - 2014/02/25 (火) 16:12:57 - トト よろしく御願いします。 ふだんは、アガロース泳動後にカラムでPCR産物（300〜1000bp）を精製してBigdyeでダイレクトシーケンスをしています。これまでに使用したことが無いのですが、時間短縮などの理由で、Exosapに興味をもち、購入を検討しています。 そこで次の点に質問です。 PCR反応液の中にプライマーダイマーが存在しているかどうかは、ほぼ同じ長さのプライマーが存在しているため、アガロース泳動の際には気づきにくいのではないかと考えています。そしてプライマーダイマーが存在していると、Exosapは壊してくれない訳ですが、Bigdyeでダイレクトシーケンスをすると正しくシーケンスできなくなるのでしょうか？ プライマーダイマーが無くても、シーケンス用プライマーのすぐ下流は読めないことが多いと思います。プライマーダイマーがあると、もうちょっと長い範囲のシーケンス用プライマーの下流が読めなくなるのでしょうか？それとも、誤った配列情報を得てしまうのでしょうか？あるいはシーケンス反応自体に悪影響があるのでしょうか？ PCR用プライマーが20bpならば、プライマーダイマーは長くても30bpぐらいだろうと想像しています。

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