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ありがとうございます 削除/引用 No.2850-6 - 2014/02/28 (金) 12:43:45 - ohira hajime様 ご丁寧な情報を本当にありがとうございます。 ResearchgateのForumも知らなかったので、そのような情報サイトがあることを知れたこともとても有難いと思っております。 分離作業による誤差の影響も考え、データ取りはEDTAに統一しようと思っておりますが、ヘパリンによる分子への影響についても時間が出来たら精査してみようと思います。 この度は本当にお世話になり、ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2850-5 - 2014/02/27 (木) 01:54:27 - Hajime >すぐに計測していても、回収の過程や計測までの間に他の細胞に影響を及ぼしている可能性もあると考えてよいでしょうか。 短時間でしょうから、申し訳ないですが正直私には実際にPLTを介しての影響があるのかどうかは、なんとも言えません。 ResearchgateのForumで以下のような投稿がありました。 http://www.researchgate.net/post/Is_there_an_advantage_to_using_EDTA-coated_tubes_rather_than_heparin-coated_tubes_for_collecting_human_blood_to_purify_granulocytes Is there an advantage to using EDTA-coated tubes rather than heparin-coated tubes for collecting human blood to purify granulocytes? There's some discussion in our lab that EDTA-coated tubes may be better for collecting human blood by phlebotomy, rather than using heparin-coated tubes, in order to achieve higher yields of eosinophils and neutrophils. Does anyone have any experience in comparing these two types of blood collection tubes? その中で Heparin activate the PMN cells. EDTA is better if you want to avoid priming reaction to inföammatory cells. The priming happens anyway but slowlier with EDTA. という回答がありました。 ヘパリン自体がPMNを活性化させてしまうそうなので、 もしかしたらohira様が目的とされている細胞へもヘパリン自体が影響し、 分子X−APCへも影響が出てしまっているのではないでしょうか？ The effects of heparin and related molecules upon the adhesion of human polymorphonuclear leucocytes to vascular endothelium in vitro. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10711352 PMID:10711352 ohira様が2つ別々の方法で患者様から採血を行い研究をされていて、 EDTA全血とヘパリン採血で目的分子Xに違いがあるのであれば、 対処を模索するのではなく、 それらの違いをありのままデータ解析し発表するのがいいと思うのですが。 異なる採血で目的分子Xの発現が違うのであれば、 それはとても有意義な発表に繋がるのではないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2850-4 - 2014/02/26 (水) 08:50:03 - ohira TK1様、HAJIME様、ありがとうございます。 確かに全血は顆粒球も含まれますが、FSC vs SSCでリンパ球と顆粒球はdot plotが大きく異なりますので、リンパ球はリンパ球の集団としてきれいに検出できるという認識をしてきました。へパ分離PBMCでは当然さらにしっかりとリンパ球の集団がクリアに検出できますが、全血でもFSC vs SSCで同じサイズのところにリンパ球の集団があります。しかし、全血ではそのリンパ球の集団として見える集団の中にも他の細胞が実際には入り込んでいて、それが分画％に影響しているということですね。 抗体はCD3FITC、CD16/56PE、分子X-APCです。 HAJIME様、文献ありがとうございました。へパ分離では血小板が確かに凝集してきます。特に今回データ時の回収では多かったです。すぐに計測していても、回収の過程や計測までの間に他の細胞に影響を及ぼしている可能性もあると考えてよいでしょうか。 データを介入前後で比較したいので、検体はどちらかに統一してデータをとりますが、分子X−APCに関しては全血6％に対しへパ分離0.9％なので、あまりの違いに困惑しております。

(無題) 削除/引用 No.2850-3 - 2014/02/26 (水) 02:04:24 - Hajime ohira様、 TK-1様が仰られているように、血球を主に除去したサンプルと比重遠心で特定の分画（主にリンパ球）を選択的に取ってきたサンプルを比べている場合、それ自体、私も直接比較することには無理があると思います。 それに加え、ヘパリンは血小板の非特異的凝集を起こす可能性があるため、Lymphocyteに影響し、もともとEDTAでのサンプルとは違うのではないでしょうか？ 参考までに Whole blood analysis of leukocyte-platelet aggregates. PMID:18770779 Platelet–lymphocyte cross-talk PMID:18198208

(無題) 削除/引用 No.2850-2 - 2014/02/25 (火) 22:02:49 - TK-1 溶血で赤血球を主に除去した結果と、比重遠心で特定の分画（主にリンパ球）を選択的に取ってきたものとでは中身が違っても当然だと思いませんか。それを直接比較することに無理があると思います。 人の白血球の中で６−７割は好中球です。フィコール分離後では好中球はあまり残りません。 単純にEDTA加全血を半分に割って二つの方法を比べれば何が消えて何が残っているのかわかるはずです。 こういうことを質問するならよほど特殊な抗原を見ているのでなければどの抗原に対する抗体で染めたかぐらいは書いた方がいいんじゃないでしょうか。

FACS 全血と分離検体の結果の乖離 削除/引用 No.2850-1 - 2014/02/25 (火) 14:24:03 - ohira ご教示、お願い申し上げます。 FACS解析についてです。 ヒトリンパ球を検体としているのですが、EDTA全血とヘパリン採血後のFICOLL分離検体で、結果が大きく乖離するのです。 全血検体はBDプロトコールに従い、全血で抗体反応後、溶血剤で処理したのちに測定しております。FSC　VS　SSC　DOT PLOTはきれいです。 分離検体はFICOLL分離を速やかに行い、こちらもFSC　VS　SSC　DOT PLOTはきれいです。どちらもリンパ球がきれいに集団で見ることができます。 PE、FITC,APC3種で染めて測定しました。 いずれもisotype contはきれいにnegativeです。 まずリンパ球をゲートしてPE vs FITCでのquadrant statを算出しましたが、4分画の％が大きく異なるのです。たとえば、UL分画がEDTA全血15％に対し、分離検体は32％です。 またAPC vs FITCで展開したものについても、EDTAではAPC抗体の陽性が6％あるのに対し、分離検体では0.9％です。 分離検体では分離の作業により若干のデータの差が生じることは承知しておりますが、なぜこんなに乖離するのでしょうか。また、どのように対処すればよろしいのでしょうか。 未熟な質問で申し訳ございませんが、どうぞよろしくお願い申し上げます。

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