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(無題) 削除/引用 No.2840-10 - 2014/02/22 (土) 01:45:52 - みん 皆様 沢山のコメント本当にありがとうございます。 APさんの言うとおり、ポジコンを置くべきですね。すみません。 何がポジコンになるのかよくわからず、調べもせずに実験してました。反省します。 スキムミルクは雪印？の食用の物を使用しています。精製という観点からも、ナカライやその他のメーカーから出されているものより実験上問題となるような成分が多いのかもしれません。非常に勉強になります。 ねずみさんのコメント、非常にありがたいです。 私の結果と全く一緒ですので是非一度上手く行った条件で検討させていただきます。 皆様からのコメントをいただく前に見つけたGEのサイトに書かれていたこととしてストレプトアビジン-HRPはTBSTで希釈し反応させるとありましたので、それと合わせてもねずみさんを始めAAさん、APさん、半さんからいただいたコメントが非常に肝だと思いました。 ブロッキングはしない方がよいのかと思っていましたがやはりスキムミルクでブロッキングだけはしておく方がバックを抑えられるのかもしれませんね。 近々再検討を行いますので、またここに結果を記載させていただきます。

(無題) 削除/引用 No.2840-9 - 2014/02/22 (土) 00:21:33 - AP >5%スキムミルクでブロッキング >wash後、wash bufferでストレプトアビジン−HRPを希釈し反応 >wash後検出→上手く検出出来た いいね！ >昔、はまったときはRocheのblockingで解決できました。 いいね！ 主成分はスキムミルクと同様、ミルクカゼインですが"高度に精製されている"と称するものですね。高いけど。

(無題) 削除/引用 No.2840-8 - 2014/02/22 (土) 00:08:44 - 半 昔、はまったときはRocheのblockingで解決できました。

(無題) 削除/引用 No.2840-7 - 2014/02/21 (金) 22:58:41 - ねずみ 参考になるかわかりませんが、私の経験を書きます。 5%スキムミルクでブロッキング 5%スキムミルクでストレプトアビジン−HRPを希釈し反応 wash後検出→シグナルを全く検出できず 当初は真っ黒（X線フィルムで）になると思っていました。スキムミルク中のビオチンはメンブレンに付着しにくいのかもしれないと思っています。 5%スキムミルクでブロッキング wash後、wash bufferでストレプトアビジン−HRPを希釈し反応 wash後検出→上手く検出出来た BSAやSuperBlockでブロッキングするとレーン全体が真っ黒でした。 泳動するタンパク質量やストレプトアビジン−HRPの濃度を調整すればBSAでも上手く行くのだと思いますが、上記２番目の方法で上手くいったので検討しませんでした。 スキムミルクはスーパーで購入した300円程度のものです。上記１番目の条件ではスキムミルク中のビオチンに食いつくされたのかも知れません。 細胞内にはビオチン化したタンパク質の他にもストレプトアビジン結合タンパク質なるものが存在するそうです。上記２番目の方法でも目的外のバンド（強いのもが２本、弱いものが多数）が検出されました。当然ですが適切なポジコン、ネガコンが必須です。 上記１番目の方法でもストレプトアビジン−HPRの濃度を上げれば上手くいくかもしれません。もしくはスキムミルクのグレードも関係があるのかもしれません。ですので、独り言さんの仰ることもAPさんの仰ることも、どちらも私には納得できます。

(無題) 削除/引用 No.2840-6 - 2014/02/21 (金) 16:19:14 - AP 一口にスキムミルクといってもブランド、グレードがいろいろですからねえ。 中には、スーパーの食品売り場で仕入れたようなものを使っているところもあるし。 うちではナカライのスキムミルクを使っています。

(無題) 削除/引用 No.2840-5 - 2014/02/21 (金) 15:09:17 - AA スキムミルク入りブロッキング剤で希釈されるわけですから、 液中のフリーのビオチンに食いつくされることはありうるのではないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2840-4 - 2014/02/21 (金) 13:12:12 - AP ビオチン化反応は確実にできているという裏付けはあるのでしょうか。全くビオチン化に失敗しているとか。 なにかビオチン化タンパク質の標品をポジティブコントロールにしてみていますか。ビオチン化タンパク質マーカーとか、ビオチン化抗体とか。 あるいは大腸菌のライセートを泳動しても、内在性のビオチン化タンパク質（BCCP)が見えると思います。 うちではブロッキングは、SA-PO検出の時もスキムミルクで日常的にやっていて問題ないですが。 ブロック剤に含まれているビオチンが問題なら、バックが真っ黒になることはあっても、バンドがでない理由にはならないような。 あるいは、SA-POがブロッキング剤中のビオチンに食いつくされるということがあるのかしら。

(無題) 削除/引用 No.2840-3 - 2014/02/21 (金) 08:58:54 - みん >独り言さん そうだったんですか！ cstの抗体を使用して実験したので、データシートを参考に実験したのですが、全くバンドが検出されませんでした。正確にはモヤモヤした黒いシグナルが散在性に見られるような結果でした。目的の高さにはバンドは見られませんでした。https://www.cellsignal.com/pdf/3999.pdf BSAでブロッキングし、再度検討してみます。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.2840-2 - 2014/02/21 (金) 02:28:52 - 独り言 アビジンHRPにスキムミルクは御法度です。ビオチンはそもそもビタミンの一種ですから。スキムミルクに入ってます。 BSAなどでブロッキングしましょう。

ストレプトアビジン-HRPによる検出について 削除/引用 No.2840-1 - 2014/02/21 (金) 02:03:16 - みん ウエスタンでビオチンを結合させたタンパクとストレプトアビジン-HRPを結合させて検出を試みたのですが、バンドが全く見られませんでした。 ストレプトアビジン自体を使うのが初めてなのですが、ブロッキングが強いものでは検出が困難になるのでしょうか？ 今回の実験では5%スキムミルクで反応させています。

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