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(無題) 削除/引用 No.2829-11 - 2014/02/19 (水) 12:40:57 - おお あ、0.5M NaCl/20mM Tris(7.9)/5mM imidazoleでだめな理由はあまりありません。大量のペプチドが混入するので、どうだろうimdazoleいれてそこまできびしくしなくてもというきもしますが、たまにHisでさらに免疫沈降するときはわたしはimidazoleをwashはbinding bufferにいれません。ノンスペはふえるでしょうけど、その後のIPでさらに精製がすすむので。 この辺は好みと、バックグランドのでかたしだいかと。 Trisは前述のように弱い結合の場合ふりです。もしその条件で結合するのがわかっているならいいですが、わたしはphosphate bufferでたいてい代用します。FLAGpeptideなどを入れた場合のpH変化がきになるなら、100mMぐらいのphosphate bufferでもいいでしょう。 塩濃度が高いですね、、、目的の蛋白の相互作用が外れなければいいのですが、、、あと塩濃度がたかいといくらかanti-flag antibodyが外れてくるかもしれません。外れてもそのままFLAGpeptideを除かないでhisにかけるとあまり邪魔をしないとおもいますが、、、あとはどのていどpeptideがNi-His相互作用に影響するかですね。。。大きな影響はないとおもいますが、経験があまりないもので、、、

(無題) 削除/引用 No.2829-10 - 2014/02/18 (火) 12:41:31 - おお sigmaのプロとコールだとTBSになってますね。Niカラムはアルカリ性でカラムの結合を阻害するものが混じってなければいいので、TBS (50 mM Tris-HCl, pH 7.4, with 150 mM NaCl)でいいかもしれません。TrisはよわいHis-Niの結合にふりですから、phosphateにかえるか、薄めにするか。FLAGpeptide がちょっとモル濃度でどれくらい入っているかわからないですが、アミノ酸はNiカラムの結合阻害をしますので、濃度によっては、回収後うすめるとか、透析とか考えた方がいいかもしれません。 確実なのは透析をかますことでそうするとバッファー置換できるのであまり考える必要はないかもしれません。1.5mlチューブのスクリューキャップに透析膜が着いたものとか売ってるので、まあ気軽に透析とかで切ると思いますし 。

(無題) 削除/引用 No.2829-9 - 2014/02/18 (火) 05:50:15 - U おおさん 再度、感謝いたします。FLAGペプチドで溶出するという発想がなく、Niカラムが先と思い込んでいました。この場合、His-tag用のバッファーにFLAGペプチドを混ぜて溶出すれば、そのままNiカラムにアプライできると理解してよろしいでしょうか？　直接Niカラムにかける時は、培養上清をそのまま通して、0.5M NaCl/20mM Tris(7.9)/5mM imidazoleで洗った後、imidazole gradientにかけているのですが、このwash bufferにFLAGペプチドを入れたもので、M2抗体からの溶出は問題ないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2829-8 - 2014/02/18 (火) 02:03:50 - おお Ni columnでひっかけて、溶出してきたものをFLAGでさらにIPであれば、かなりバックグランドはかいぜんするかもしれません。ぎゃくでもいいですが、FLAGpeptide溶出になりますよね。

(無題) 削除/引用 No.2829-7 - 2014/02/17 (月) 21:32:58 - U 名無しさん 返信ありがとうございます。論文については、ボスの意向によるので、何とも言えません。私が仕事している国（日本国外です）では、マイナージャーナルに出しても大学研究者の業績として評価されないシステムになっており、なるべくしっかりした形にして論文にする事が求められているので、ちょっと難しいと思います。

(無題) 削除/引用 No.2829-6 - 2014/02/17 (月) 20:52:48 - 名無し 偶然にしろせっかく見つけたのだから、PDGF-Aの新規精製法として論文にすればいいのに。PDGFの研究してる人には有用な方法になるとおもうし。そういう内容の論文を載せるジャーナルあるよ。

(無題) 削除/引用 No.2829-5 - 2014/02/17 (月) 19:12:45 - U おおさん いつもの事ながら、適切なアドバイスありがとうございます。MockコントロールサンプルでM2抗体に結合するエンドのたんぱく質を、あらかじめ調べておくのは、良いアイデアと思いますので、やってみます。とりあえず、denaturedのIgGと結合しない（とされている）２次抗体を使ってみます。 このコンストラクトは、たんぱく分離の目的で、3xFLAGの上流にHisを入れてあるのですが、手違いでHis4（His6ではなく）になってます。Niカラムでは30mM程度のimidazoleで溶出してしまい、バックグラウンドとの分離が悪いのですが、それでも直接M2抗体でIPするよりはいいかもしれませんね。His6-3xFLAGのコンストラクトを作り直しているので、こちらを使うのも手ですが、imidazoleがどの程度たんぱく質相互作用に影響するのか、気になります。もしimidazoleがdose-depenentに影響するのであれば、逆にHis4で少量のimidozoleによる溶出の方が良いのかもしれません。いずれにせよ、この手の実験に関して初心者なので、imidazoleによる溶出が適切な方法かどうか、御意見伺えますでしょうか。 あと、細胞内局在を見る目的でGFP-tagも準備しているので、GFP-trapで同様の実験をして、比較してみたいと思います。 monさん M2抗体がFLAG内のどこを認識しているのか調べがつかなかったので（調べ方が悪かったようです）、DYKDxxx(D)を認識するとの情報、本当に助かります。シーケンスである程度スクリーニングできると、手間が省けます。どうもありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.2829-4 - 2014/02/17 (月) 13:57:15 - mon 一つのタグだとどうしても非特異的結合物が取れてしまうので、特異性を高める手法としてTandem affinity purification (TAP) Methodが開発されたのでしょう。

(無題) 削除/引用 No.2829-3 - 2014/02/17 (月) 13:53:19 - mon たしかM2抗体の認識配列はDYKDxxx(D)だったと思います。 PDGF-Aのアミノ酸シーケンスDYREが似ていますね。 また、ラット肝臓抽出液でのWBでM2抗体に反応するバンド(30kDaだったかな？モノは不明）がでた記憶があります。

(無題) 削除/引用 No.2829-2 - 2014/02/17 (月) 07:21:36 - おお 印象としては、FLAGで引っかかってくるエンドの蛋白はほとんどないような気がしますが、分泌系の蛋白はあまり見ないので、、、 もしIPで引っかかるぐらいならWBでもみれるだろうなとおもうと、IP後FLAGでWBしてノンスペがどのていどみられるか見てもいいかもしれません。ただIgGが強く染まるので工夫が必要かもしれませんけど。 MASSにしろ、negative controlをおけば、万が一結合していなくてもほかの理由で引っかかる場合オミットできるので(ネガという判断はできませんが)、それでやってみるのがいいかと。mycをつけた別のコンストラクトをつくれば、FLAGで確認できなかったものはそっちでポジと出るかもしれません。またはtandemにtagをつけたりというのもありますが、抗体を使わない、レジンからはがしやすいtagでないとむずかしいですね。 MASSでFLAGでネガティブコントロールで引っかかるものを確認して、それらは別途mycなど違う方法で調べてみるというても取れるでしょう。

FLAG M2抗体の特異性 削除/引用 No.2829-1 - 2014/02/17 (月) 06:18:37 - U いつもお世話になっております。FLAG M2抗体（Sigma）を用いてCo-IPの実験をしているのですが、気になる点があり、皆様の御意見伺えますでしょうか。 ある分泌たんぱく質のC末にFLAG-tagをつけて、HEK293TにPEIでtransfection後、培養上清中でその分泌たんぱく質とinteractするenodogenousの増殖因子を調べています。残念ながら、そのたんぱく質に対する手持ちの抗体はウエスタン（denatured）では使えるのですが、nativeのたんぱく質に結合しないので、FLAG M2抗体で落としています。実験目的の関係で、まずPDGF-AとTGFbから見ているのですが、予想外な事にMockコントロールから取った上清から、FLAG M2抗体でPDGF-Aが落ちてきました。一方、目的のたんぱく質をtransfectした細胞の培養上清のIPでは落ちてきません。この結果から、M2抗体がPDGF-Aと結合する事、その結合はFLAG-tagされた目的のたんぱく質と競合する事、が示唆されます。TGFbはどちらの培養上清からも落ちてきません。PDGF-Aのアミノ酸シーケンスを見るとDYREEDTGという配列があり、FLAG（DYKDDDDR）と似ていなくもないのですが、Dが並んだ配列は存在しません。 今後、増殖因子の種類を増やし、mass-specも併用して実験していく予定なのですが、FLAG M2抗体と結合するendogenousのたんぱく質がPDGF-A以外にも色々あるようだと、今後のデータ解析で問題になる可能性があります。私自身M2抗体を使うのは今回が初めてのため、皆さんの経験（M2抗体の特異性に関して）を聞かせて頂けませんでしょうか。よろしくお願いします。

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