全10件 ( 1 〜 10 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.2816-10 - 2014/02/13 (木) 09:38:27 - mon >[Re:8] ppさんは書きました : > low-copyのプラスミドを入れる場合、プレートや液体培地中の > 抗生物質の濃度はhigh-copyのときよりも下げたほうがいいのでしょうか。 基本的には大腸菌が増殖しない最低濃度を使用します。ライブラリー作製など実験条件がシビアな場合は使用している菌株で条件検討します。まあ、そんなに一般的な濃度からはズレませんが。 （Ampのように分解酵素が培地中に蓄積するものは要考慮ですけど） low-copyのプラスミドなら耐性遺伝子の発現量も低いので、Zeocinは50ug/mLが良いかもしれません。 なおZeocinはLBなど塩濃度が高い(10g/L)培地だと沈殿する（可能性がある？）そうなので、私はSOB培地を使っています。

(無題) 削除/引用 No.2816-9 - 2014/02/12 (水) 23:50:46 - tany たしかDH5a株は相同組換え能欠損型だったと思いますが，そのことは今回の実験に関係はしませんか？

(無題) 削除/引用 No.2816-8 - 2014/02/12 (水) 19:40:08 - pp 皆様 すごく基本的なことかもしれないのですが、 low-copyのプラスミドを入れる場合、プレートや液体培地中の 抗生物質の濃度はhigh-copyのときよりも下げたほうがいいのでしょうか。 ちなみに今回の場合、pKD46がlow-copy、zeocin耐性で、 final100μg/mlになるようにzeocinを培地に加えています。

(無題) 削除/引用 No.2816-7 - 2014/02/12 (水) 16:42:57 - 中年 ケミカルコンピテントセルの時の経験ですが、本カルチャーを抗生物質入りの培地で行ったことがあったのですが、形質転換効率がすごく悪かった経験があります。 高効率のためにエアレーションに気を付けたり、SOBなどのリッチな培地を使ったりするのは、全て大腸菌の生育条件をベストにするための工夫だと思うので、抗生物質を入れてそこに制限を掛けることが悪さをしているのではないかと考えました。 抗生物質の種類にもよりますし、プラスミドの安定性にもよると思いますが、プレカルチャーで選択を掛けておけば、本カルチャーでプラスミドを落としたとしても数％のことでしょうから、本カルチャーにまで抗生物質を入れることは基本的には百害あって一利なしだと私は思います。

(無題) 削除/引用 No.2816-6 - 2014/02/12 (水) 16:32:51 - pp 中年様 本カルチャーをただのSOBでやるというのはどのようなことを 期待してのことでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2816-5 - 2014/02/12 (水) 14:00:39 - 中年 プレカルチャーは抗生物質入りの培地を使うけど、本カルチャーは抗生物質抜きのSOBでやってみてはどうですか？

(無題) 削除/引用 No.2816-4 - 2014/02/12 (水) 12:52:37 - pp mon様、~様 書き込みありがとうございます。 ワークしていた系なので特にコントロールは置いていませんでした。 （ただ研究室が変わって環境的には違うのですが、機械類は同じです。） pKD46はアラビノース誘導でλred recombinaseが発現するプラスミドで 30℃で保持、37℃で脱落するタイプです。 とりあえず、 pKD46が入っていてrecombinaseを発現させたエレクトロコンピに 16kbのプラスミドと組換えのフラグメントを同時あるいは sequentialに入れてみます。 recombinaseさえ発現していればpKDは要らないので、 もしpKDと16kbのプラスミドが競合しているとすれば 同時に入れることでうまくいくかもしれません。 それから、効率チェック用のコントロールもやってみます。 結果は後日報告いたします。

(無題) 削除/引用 No.2816-3 - 2014/02/12 (水) 12:20:09 - ~ M13 oriのプラスミドを持った大腸菌に対して、エレクトロポレーションで入れていましたが、10^7 cfu/ug DNA以上の形質転換効率はありました。 コントロールの結果の情報が書かれていませんが、 ・pKD46を持たないDH5aでの形質転換効率 ・pKD46を持つDH5aに対してのpBS等の小さいベクターの形質転換効率 あたりのデータを確認すると、エレクトロポレーションの条件が適当であるかや、ベクターサイズの影響などが分かりますね。

(無題) 削除/引用 No.2816-2 - 2014/02/12 (水) 12:12:39 - mon pKD46はどのようなplasmidでしょうか。皆が知っているわけではないので説明不足です。 （pKD46は37℃で複製できないplasmidだとして、エレクトロポレーションの後、30℃で培養していますよね。） といいつつ、逆はどうでしょうか。 pKD46を保持するDH5aに、(1)16kb程度のプラスミドを入れる、(2)もしくは16kb程度のプラスミドと組換え用断片を同時に入れる、とか。 RedET系の組換えの場合は、(2)を順番を使ったような記憶があります。

DH5aのエレクトロポレーションについて 削除/引用 No.2816-1 - 2014/02/12 (水) 09:09:58 - pp いつも参考にさせていただいております。 現在16kb程度のプラスミドを保持したDH5aにpKD46をエレポで入れて その後16kbプラスミド上で相同組換えを起こそうとしています。 プラスミド保持大腸菌はプレカルチャー後、20mlSOB+抗生物質でOD=0.5程度まで増やし、 4℃で集菌、10%グリセロール（invitrogenのUltraPure）でwashを５回繰り返し、 最終的に50μlの菌液を作製しました。 100ngのpKD46を混ぜ、cell projectのキュベットで、 bioradのgene pulserIIで200Ω、25μF、2.5kVでエレポして SOCを1ml加え、30℃で1.5h培養して100μlを播きました。 しかしコロニーが10個程度しか生えてきませんでした。 pKD46を入れた後に組換えを起こすフラグメントを入れるのですが、 pKD46のエレポでこの成績だと組換えは絶望的な気がします。 以前BACでやっていたことがあるのですが、そのときは ケミカルコンピにプラスミドをトランスフォームしたときくらい かなり生えてきました。 プラスミドを多コピーすでに保持している大腸菌にさらに入れるのは 難しいなどあるのでしょうか。 考えられる原因や対策など知恵をお貸しいただければ幸いです。

全10件 ( 1 〜 10 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---