全11件 ( 1 〜 11 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.2802-11 - 2014/02/19 (水) 15:41:59 - mk つんさん 　 お返事遅くなりすみません。 タグをつけてベクターに入れなおすの試してみようと思います。 ありがとうございました！

(無題) 削除/引用 No.2802-10 - 2014/02/13 (木) 16:31:42 - つん pFASTbac1はタグないですもんね。 他のベクターで標的タンパクのC末にV5/Hisタグをつけたものがあったので（前任者が作製）、それを基にしてタグごとpFASTbac1に入れました。

(無題) 削除/引用 No.2802-9 - 2014/02/12 (水) 16:53:53 - mk つんさん ありがとうございます。培地はそのままで良いのですね。 プロトコルにトランスフェクションの時はGraceと指定されているのですが、普段はSFMで培養してるのでトランスフェクション後どちらにするか迷っていたのです。 タグですか…！私はPFastBac1を使ってBacmidを作製しているのでタグが付かないと思われます。ベクター変えるのも検討しなきゃですかね。。

(無題) 削除/引用 No.2802-8 - 2014/02/12 (水) 09:23:27 - つん > ところで、トランスフェクション後のP2,P3を作製する際、培地にFBSやPSを添加されていましたか？ 継代培養で使っている培地をそのまま使いました。 血清は5%、抗生物質は普段から入れていません。 あと、私の標的タンパクも抗体がなかったので、タグを付けてタンパク質レベルでの発現を確認しましたよ。

(無題) 削除/引用 No.2802-7 - 2014/02/10 (月) 10:29:43 - mk おおさん 発現させるタンパク質に対する抗体がないので、とりあえずqPCRでtiterが測定できるキットを使ったのです。。

(無題) 削除/引用 No.2802-6 - 2014/02/08 (土) 14:24:38 - おお タンパクはできたか見てないの、、、なんでDNAで見てるのか不思議

(無題) 削除/引用 No.2802-5 - 2014/02/07 (金) 17:20:30 - mk つんさん ありがとうございます！ 調べたところバクテリアのコンタミの可能性が考えられたので先ほど新しい培地でトランスフェクションし直してみました。 実は以前BacmidをMiniprepだけしたものをトランスフェクションしたとき、その軽くたたくと剥がれてくる状態になったのですが、あまりにも時間がかかったのでMidiprepを行ったのです。GFPも同時にやったのですが光り方が弱くて…。 DNAの抽出もリアルタイムPCRも初めてで自信がないのですが、まずはそのように感染が起こるまで頑張ってみようと思います。 私の研究室では今回初めて昆虫細胞を導入し聞く人がいなかったのでありがたいです。 ところで、トランスフェクション後のP2,P3を作製する際、培地にFBSやPSを添加されていましたか？

(無題) 削除/引用 No.2802-4 - 2014/02/07 (金) 16:55:36 - つん 疑わしきはバクミドだけではありませんよね。 細胞自体あるいは培地に極々微量にコンタミしているとか。 バキュロウイルス発現系は私もまだ初心者の域なので、以下はあくまでも私の場合はこうでした。というお話ですが… 標的タンパク質の他にGFPのバクミドも作り、GFPの蛍光を目安にして作業を進めました。 cellfectinによるトランスフェクション（TF）は効率が非常に悪く、3日程度では感染が全体に広がっておらず、細胞の溶解もみられませんでした。 たしか1週間後くらいにようやく細胞全体でGFPが光っているのが確認できて、上清を回収したと思います。 このとき、顕微鏡で見ると多くの細胞は丸い形を維持しているが接着力が弱く、プレートを軽く振るだけで剥がれました。 細胞が“溶解する”というより、剥がれる、浮いてくるという感じでした。 細胞が剥がれて浮遊している培養液は白く濁って見えるので、あなたのケースもコンタミ決定ではないと思います。 ウイルスDNAの抽出やリアルタイムPCRの方には問題ありませんか？

(無題) 削除/引用 No.2802-3 - 2014/02/07 (金) 13:45:18 - mk つんさん 回答ありがとうございます。 やはりコンタミなのですかね、、？ プロトコルには72時間以上経つと細胞がはがれて溶解する、と書いてあったので感染のサインかと思ってしまいました。 ４種類のbacmidでトランフェクションして全てそのようになったのですが、bacmidの溶液自体がコンタミしているのですかね…？

(無題) 削除/引用 No.2802-2 - 2014/02/06 (木) 17:03:03 - つん 白く濁ったのならば、失礼ながらコンタミではありませんか？

昆虫細胞の感染 削除/引用 No.2802-1 - 2014/02/06 (木) 16:46:12 - mk Sf9にウイルスを感染させてタンパク質を発現させるBac to Bacシステムで実験を行っております。 cellfectinを用いてトランスフェクションした後も、その上清をプレートにまいた細胞に添加した後も3日目には細胞が溶けたようになり培地全体が白く濁りました。プロトコルにある、核が大きくなる、というサインはうまく観察できませんでした。 これで感染がうまくいったと思い込みリアルタイムPCRでコピー数を計測してみたのですが全く値が出ませんでした。 昆虫細胞の経験がある方、よろしければ感染がうまくいくとどのようになるかご教授ください。

全11件 ( 1 〜 11 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---