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(無題) 削除/引用 No.2791-7 - 2014/02/03 (月) 05:56:45 - おお >> 特に酵素活性とか蛋白質の生物活性を測る場合は添加する阻害剤の作用機序とかは事前にチェックして添加するべき >それはごもっとです。 私もつくづくそう思うのですが、rocheのprotease inhibitors mixとかなかみがわからん(とおもっている)のがあったりしてどうももやもやしている。なんでそんなやつを使って何にも気にならないんだろうとか、、、 あ、これは質問に直接関係ないです。 組成があきらかになっているならまあその通り自前でつくればいいはずですが、売っているやつに使っているケミカルのグレードとかがわからないでしょうから微妙な違いがあるかもしれません。実験にどの様に影響するかはなんともいえません。 抽出してWBならインひビターが2倍だろうが、自前のバッファーだろうが、個人的にはあまり変わらないだろうとおもいますが(無責任な発言として)、いちおうその時のデーターはそういうのを使ったという意識をしておき、変であれば検証できるようにしておくといったことはしておいた方がいいとおもいます。

(無題) 削除/引用 No.2791-6 - 2014/02/03 (月) 00:21:42 - Santa >[Re:4] 名無しさん > 同じ組成のbuffer（ただしこれにはinhibitorは入れない）50ml作って足して100mlにすればいいだけとおもうんだが。 やはりそれが無難ですかね。 > 特に酵素活性とか蛋白質の生物活性を測る場合は添加する阻害剤の作用機序とかは事前にチェックして添加するべき それはごもっとです。 以前からラボで使われ続けていて、データも出せているのでこの組成を用いているのですが、機序を理解しなければなりませんね。 ご指摘ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.2791-5 - 2014/02/03 (月) 00:12:24 - Santa >[Re:3] おおさん >[Re:2] おおさん なるほど。。。 SantaのRIPAは組成が公開されていますね。 もはや自作で作るかとも考えましたが、今まで既製品を使用してたところから 自作を混ぜるのに抵抗がありました。

(無題) 削除/引用 No.2791-4 - 2014/02/02 (日) 23:20:29 - 名無し 同じ組成のbuffer（ただしこれにはinhibitorは入れない）50ml作って足して100mlにすればいいだけとおもうんだが。 別にそのままでも問題ないのかもしれないけど、inhibitor溶かしている溶媒がもしDMSOだとそこそこの濃度になるとHDACとか、Free radicalのscavengingとかそっち系に影響する可能性もゼロでないかなあとかは少し思うけど。 化学とか薬理とか系じゃないので難しいことはあれなんだが、素人なりに考えるには、プロテアーゼインヒビターとはいっても、化学合成した化合物の場合はどこの働くかその特異性には注意した方がいいと思う。（たとえばcysteine proteinase inhibitorとかアルキル化剤関係だと他のSH-基が重要な酵素も抑えてしまうかもしれないし）、特に酵素活性とか蛋白質の生物活性を測る場合は添加する阻害剤の作用機序とかは事前にチェックして添加するべきかどうかの妥当性を検討することは必要に応じて考えた方がいいとおもう。

(無題) 削除/引用 No.2791-3 - 2014/02/02 (日) 23:17:31 - おお ところで、サンタのRIPAは何が入っているか公開しているのでは。。。

(無題) 削除/引用 No.2791-2 - 2014/02/02 (日) 23:16:14 - おお 無責任に発言するなら。まあ大丈夫でしょう。データーは倍の濃度で行ったということで出るのでは。 抽出という観点では、蛋白が溶けなくなるとか"ほとんど"ないとおもいます。99.9%ぐらいかな。

Protease ＆　Phosphatase　Inhibitor　を入れすぎると… 削除/引用 No.2791-1 - 2014/02/02 (日) 22:38:33 - Santa Protease Inhibitor Cocktail やPhosphatase Inhibitor を調整ミスで Buffer 100mlに1ボトル入れるところを50mlに1ボトル入れてしまいました。 さらに50ml Bufferを加えれば問題ないのでしょうが、急ぎでデータを出さねばならない状況で、発注・納品を待つことができません… Protease ＆　Phosphatase Inhibitorの濃度が濃すぎると、タンパク抽出に影響は出るのでしょうか？ BufferはSantacruzのRIPA Lysis Buffer System Protease ＆　Phosphatase InhibitorはSigmaの Protease Inhibitor Cocktail for general use Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 Phosphatase Inhibitor Cocktail 3 を使用しております。

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