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(無題) 削除/引用 No.2786-16 - 2017/10/22 (日) 07:36:01 - TK-1 >[Re:5] 修士さんは書きました : > >LiClで洗うというのもやっているのがありますよね。300mMぐらいだったかな > > dyanbeadsでは試していません。現在使用しているのはRIPA buffer(150 mM Nacl, 25 mM HEPES ph 7.6, 1 mM EDTA, 1 % Triton-X100, 0.1 % SDS, 0.1 % DOC)とTE bufferです。 > RIPA bufferで４回洗浄しているのですが洗浄の条件が弱いのでしょうか？磁気ビーズならば洗浄の効率が高いと考えているのですが。 > かなりゆるいwashですね。どこから取ってきたプロトコールか知りませんが、だいたいは500mM LiClx４くらいは洗ってますけど。それで消えるシグナルはノンスペでしょう。

vhzTIxDaKdQ 削除/引用 No.2786-15 - 2017/10/21 (土) 19:45:07 - JimmiNi Mi23EP http://www.FyLitCl7Pf7ojQdDUOLQOuaxTXbj5iNG.com

(無題) 削除/引用 No.2786-14 - 2014/02/05 (水) 14:01:13 - RBP ちょっと横槍の様な質問ですいませんが、バックグラウンドの定義を教えて下さい？ �@.TF特異的な抗体を使ってChIPしたものと、normalIgGでChIPしたものを同じ領域のPCRプライマーを使って解析して、Inputとの相対量を計算する。ChIP-ｑPCRでよく使われるやつで、この場合はnormalIgGがバックグラウンドになります。 �A.TF特異的な抗体を使ってChIPして、絶対に結合しているだろう領域と、多分結合していない領域のシグナルを比べる。normalIgGは使いません。ChIP-seqで使われるやつです。この場合は結合しないだろう領域からのシグナルがバックグラウンドになります。 �@の場合のバックグラウンドは主にWash不足だと思いますよ。 マグネティックビーズの場合wash時に間違ってビーズを吸ってしまうことが少ないですから、washの回数は多くしてみてはどうですか？ �Aの場合はSonication不足か、IP効率が悪いかですね。 時にDynabeads使用時のIP効率がAgarose beadsの時より悪くなっている可能性はありませんか？

(無題) 削除/引用 No.2786-13 - 2014/02/04 (火) 09:42:32 - おお >クロマチン濃度は25 ugといたって普通です。 単位が濃度になってませんが、、、 抗体は減らすとしても1ugぐらいは最低入れておきたいかと思います(根拠がある数字ではありませんが)。抗体によるバックグランドより、ビーズへの非特異吸着のほうが一般的によくあり得ると思いましたので、ビーズを減らした方がいいかと申し上げた次第です。抗体がバックグランドに影響しているか、ビーズがバックグランドに影響しているかは抗体抜きのコントロールをとるとわかると思います。 抗体がバックグランドに影響しているなら、抗体かえるというのも手かもしれません。wbでノンスペなど拾いますかその抗体?

(無題) 削除/引用 No.2786-11 - 2014/02/01 (土) 09:42:31 - モモ ビーズに対する非特異的結合を減らすならビーズを減らすのが良いのでは。 磁気ビーズは使ったことないですが、ビーズ25μｌは多くないですか？ あと、磁気ビーズってボルテックスしていいんですかね？ 普通のビーズなら壊れて表面積が増えてノンスペが増えるはずですが。

(無題) 削除/引用 No.2786-10 - 2014/01/31 (金) 18:08:05 - 修士 おおさん ありがとうございます。いろいろとご存じなのですね。意外な話でした しかしソニケーションをしたクロマチンの長さは推奨されている長さなので問題はないかと思います。 抗体については可能な限り低濃度で実験をしています。 アガローズビーズでの実験で得られた、シグナルがこれ以上下がらないというギリギリの濃度です。 磁気ビーズでは抗体を1/10000以下に薄めてもバックと思われるバンドが出ます。 また、改めて相談なのですが ダイナミックに条件を変えるとしたら固定、クロマチン濃度、免疫沈降のどこが結果を大きく左右すると思いますか？ 固定条件は、論文ではほとんどの方が1.8 % ホルマリンで15分間固定しています。 しかしそれでは切断と溶出のどちらもできなかったため0.5 %で10分間に変更しています。 クロマチン濃度は25 ugといたって普通です。 IPについても同じ条件で実験をされている方は多いです。 書いていて思いましたがやはりまず1.8 %のホルマリンで切断できる条件を探すべきでしょうか、、、

(無題) 削除/引用 No.2786-9 - 2014/01/31 (金) 17:12:27 - おお http://seqanswers.com/forums/showthread.php?t=24592 参考になるかどうかわかりませんがこういうのもあります。Chipではありませんが、これを見てアルデヒドの中和に10 x tris glycine buffer にしたことがあります。まあ実際に比較してよかったとかそう言うわけではないのですが、万が一中和がうまくできてなかったらというのがありましたので、

(無題) 削除/引用 No.2786-8 - 2014/01/31 (金) 17:09:32 - おお あと、ビーズの抗体吸収キャパを調べて、抗体にたいしてぎりぎりの量までビーズを減らすとか、標準プロとコールはかなり余裕を見た量(確かに抗体の量もおおめですが)でやってたりします。過剰の方が抗体吸収が効率的ではありますが、バックグランドもあげているとおもうので。

(無題) 削除/引用 No.2786-7 - 2014/01/31 (金) 16:55:30 - 修士 >一部のノンすぺには磁気ピーズのほうが優れているようですが、万能ではないです。 過信はよくありませんね。今のところは、確かにアガロースの方がバックが低い結果が得られています。 界面活性剤の濃度を上げることについては試していないので、きつい戦場バッファーも試してみます！ >IPの時間を短くするという手もあるにはあります。とくにO/Nでやっているなら。 O/Nと室温10分の条件で様子を見ているので試してみます！ 確かにビーズとのインキュベーションを2時間でIPを行うと異様に高いバックグラウンドが出たことがありました。インキュベーションの時間もバックを下げるのに重要な気がしますね。なのでこの条件も振ってみます。

(無題) 削除/引用 No.2786-6 - 2014/01/31 (金) 16:39:13 - おお >[Re:5] 修士さんは書きました : > >LiClで洗うというのもやっているのがありますよね。300mMぐらいだったかな > > dyanbeadsでは試していません。現在使用しているのはRIPA buffer(150 mM Nacl, 25 mM HEPES ph 7.6, 1 mM EDTA, 1 % Triton-X100, 0.1 % SDS, 0.1 % DOC)とTE bufferです。 > RIPA bufferで４回洗浄しているのですが洗浄の条件が弱いのでしょうか？磁気ビーズならば洗浄の効率が高いと考えているのですが。 一部のノンすぺには磁気ピーズのほうが優れているようですが、万能ではないです。DOCを1%ぐらいまであげるひともいます。DOCのかわりにCHAPSを使う人もいますし、、、DOCの濃度をあげたりCHAPAでも抗体の能力が維持できているなら、そう言うのもためすことはできるかと。 > > > まさか固定条件に依存してProtein Gが抗体以外の分子を結合しているわけはないですよね、、 > さらにこの洗浄バッファー、同じ動物とビーズを用いてパブリッシュした方がおられたですが私のサンプルではなぜか結果が出ません。 固定、断片かあたりは感触など微妙なことで左右される可能性がありますから、、、経験者がいるなら話をきいてみるといいかと。 IPの時間を短くするという手もあるにはあります。とくにO/Nでやっているなら。

(無題) 削除/引用 No.2786-5 - 2014/01/31 (金) 15:42:50 - 修士 >LiClで洗うというのもやっているのがありますよね。300mMぐらいだったかな dyanbeadsでは試していません。現在使用しているのはRIPA buffer(150 mM Nacl, 25 mM HEPES ph 7.6, 1 mM EDTA, 1 % Triton-X100, 0.1 % SDS, 0.1 % DOC)とTE bufferです。 RIPA bufferで４回洗浄しているのですが洗浄の条件が弱いのでしょうか？磁気ビーズならば洗浄の効率が高いと考えているのですが。 まさか固定条件に依存してProtein Gが抗体以外の分子を結合しているわけはないですよね、、、 固定条件は組織のホモジェネートを0.5 % PFAで室温10分の条件で固定しています。 ちなみに洗浄の際のビーズの懸濁はボルテックスミキサーを使用して、その後４℃ 5 minutes洗浄しています。 さらにこの洗浄バッファー、同じ動物とビーズを用いてパブリッシュした方がおられたですが私のサンプルではなぜか結果が出ません。

(無題) 削除/引用 No.2786-4 - 2014/01/31 (金) 15:27:33 - 修士 おおさん お早い返信ありがとうございます。 さっそく頼らせていただきます！ >抗体なしのビーズでインキュベーションして、ビーズをのぞき、非特異な吸着成分をのぞいてから、IPを行う手はあると思いますが、それをやった上でのことでしょうか? はい、プレクリアと呼ばれる手段も試したうえです。また、1 ug/ulのssDNAとBSAを利用したブロッキングも試しました。ブロッキングについてはバックグラウンドを下げる効果がありました。

(無題) 削除/引用 No.2786-3 - 2014/01/31 (金) 15:23:56 - おお LiClで洗うというのもやっているのがありますよね。300mMぐらいだったかな。。。

(無題) 削除/引用 No.2786-2 - 2014/01/31 (金) 15:22:10 - おお 抗体なしのビーズでインキュベーションして、ビーズをのぞき、非特異な吸着成分をのぞいてから、IPを行う手はあると思いますが、それをやった上でのことでしょうか?

ChIPアッセイにおけるprotein G dynabeadsの非特異結合の除去 削除/引用 No.2786-1 - 2014/01/31 (金) 14:27:49 - 修士 いつもお世話になっています。 私はキイロショウジョウバエを用いて転写因子のChIPを行っているのですが、 バックグラウンドが高くて困っています。 抗体濃度をふっても結果に変化がないため、おそらくビーズに対する非特異結合の多さに起因すると思われます。 私はこの非特異結合がサンプルに含まれるDNA濃度の高さに原因があると考えました。 そこで、転写因子のChIPとしては低濃度の5-10 ug程度のクロマチンを用いて再度実験を行うことを考えています。現在は25 ugのクロマチンを使用しています。ビーズは一回の実験ごとに、ProteinG dynabeadsを25 ul使用しています。 また、ビーズへの非特異結合はDNA-proteinのクロスリンクの時間に依存するでしょうか？ 皆様のご意見を求めます。

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